降解植物甾醇產9α-羥基雄烯二酮工程菌株構建及發酵工藝優化

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(1.上海大學生命科學學院,上海 200444;2.中國科學院上海高等研究院,上海 201210)

甾體藥物被廣泛應用于維持生命、調節機體物質代謝、促進性器官發育、維持生殖等方面,已經成為僅次于抗生素的第二大類藥物[1-2]。隨著甾體藥物市場需求的不斷提高,需要對其傳統合成路線進行不斷研究與創新,提高其合成效率和降低生產成本。利用微生物轉化降解甾醇得到重要甾體藥物中間體的研究,受到越來越多的關注[3]。9α-羥基雄烯二酮(9α-OH-AD)作為一種重要的甾體藥物中間體,通過對其活性部位進行結構改造,可以得到氫化可的松、β米松、地塞米松、可的松等多種重要的甾體藥物,具有極高的商業價值[4-7]。

目前,制備9α-OH-AD的途徑主要有兩種:一種是兩步發酵法,首先由分枝桿菌對甾醇切除邊鏈生產雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD),然后借助其他微生物(例如諾卡氏菌、紅球菌屬或工程大腸桿菌)在AD的C9位引入羥基,得到9α-OH-AD,如王康等[8]將來源于分枝桿菌H37Rv 和紅平紅球菌SQ1的KSH基因在大腸桿菌中異源表達,具有將AD轉化得到9α-OH-AD的活性;另外一種方法則是通過對分枝桿菌進行篩選和改造,以甾醇為底物通過一步發酵直接得到9α-OH-AD,如楊亞力等[9]通過篩選得到一株偶發分枝桿菌,能夠代謝甾醇直接得到9α-OH-AD。兩步法需要先發酵純化得到AD,再以價格昂貴的AD為底物發酵得到9α-OH-AD,這種制備9α-OH-AD的途徑工藝復雜并且成本較高,而通過對分枝桿菌進行改造,以植物甾醇為底物直接得到9α-OH-AD,制備工藝簡單并且成本較低,是一種極具工業化潛力的路線。

3-甾酮-9α-羥基化酶(KSH)是甾醇轉化過程中的一種關鍵酶[10-11],可以在AD的C9位上引入一個羥基,將AD轉化為9α-OH-AD[12]。KSH是一種由末端加氧酶(KshA)和鐵氧還蛋白還原酶(KshB)組成的多聚雙組分class IA型單加氧酶,KshA通常以三聚體形式行使功能,KshB通常以單體形式存在,這兩個組分需同時存在,KSH才具有活性[13-14]。除了上述兩個必需組分,KSH還需要還原態的輔基NADH作為電子供體[15]。袁家代等[16]在分枝桿菌中表達了KSH的編碼基因kshA和kshB,該菌能夠代謝甾醇產生9α-OH-AD,但是發酵液中9α-OH-AD的最大積累量僅為0.453 g/L。王貴娥等[17]在一株9α-OH-AD生產菌中通過強化KSH的活性,提高了9α-OH-AD的產量,但是最大產量僅為1.443 g/L。因此需要對分枝桿菌的甾醇代謝過程進行深入研究,構建更加高效的產9α-OH-AD的工程菌株。

因此,為提高9α-OH-AD生產水平,本研究通過在一株產AD的分枝桿菌Mycobacteriumsp.TFZ中表達3-甾酮-9α-羥基化酶基因kshA1和kshB1,來構建可以降解植物甾醇生產9α-OH-AD的工程菌株。進一步通過考察底物植物甾醇和不同表面活性劑吐溫的濃度對9α-OH-AD產量的影響,建立高效的油水兩相發酵體系,以期為實現 9α-OH-AD的進一步工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

分枝桿菌(MycobacteriumneoaurumDSM 44074,Mycobacteriumsp.TFZ)、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α均為本實驗室保藏;分枝桿菌過表達質粒pMV306 本實驗室保存；Prime STAR HS高保真聚合酶、限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ TaKaRa公司;ClonExpressⅡ一步克隆試劑盒 南京諾唯贊生物技術公司;基因組提取試劑盒、質粒小量制備試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒 Axygen公司;雄烯二酮(AD)、9α-OH-AD標品 云南生物制品;植物甾醇 江蘇越紅飼料有限公司;玉米漿 上海源肽生物技術有限公司;酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、甘油 上海生工生物工程有限公司;卡那霉素、瓊脂、吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80 上海麥克林生化科技有限公司;大豆油 中糧食品營銷有限公司;NaCl、K2HPO4、NaNO3、MgSO4·7H2O、甲醇、乙酸乙酯等 均為分析純,國藥集團(上海)化學試劑有限公司。

BSA 224S-CW型電子天平、PB-10型PH計 德國Sartorius;Centrifuge5430低溫離心機、Centrifuge5424型高速離心機 德國Eppendorf公司;DU730型紫外分光光度計 德國BecKman;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋;ZDP-A2160A型全自動電熱培養箱、ZHWY-2102C型恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;LC-2010型高效液相色譜儀 日本島津公司;S1000TM型PCR儀 Thermal BIO-RAD;Molecular Imager? Gel DocTMXR System 生物技術公司;EPS 300電泳儀 上海天能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 LB培養基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,121 ℃滅菌20 min。LB固體培養基:向LB培養基中添加瓊脂15 g/L。分枝桿菌種子培養基:酵母粉15 g/L,葡萄糖6 g/L,NaNO35.4 g/L,(NH4)2HPO40.6 g/L,吐溫-80 2 g/L,pH7.5,115 ℃滅菌15 min。分枝桿菌發酵培養基:玉米漿23 g/L,K2HPO42 g/L,NaNO32.8 g/L,葡萄糖9 g/L[18],植物甾醇10 g/L,大豆油100 g/L,pH7.5,115 ℃滅菌15 min。

1.2.2 過表達質粒pMV306-kshA1-kshB1的構建 新金分枝桿菌M.neoaurumDSM 44074基因組DNA的提取,按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作。根據基因kshA1和kshB1的堿基序列,分別設計引物P306-kshA1-F/R(atacatatgggatccgaattc GTGACTACCGA GACAGCCGG/gaagtgattcctccgaagctt TCAGCTCGGCTGAGCCGG)對kshA1基因進行擴增,設計引物P306-kshB1-F/R(gctcagccgagctgaaagctt GTGCTCGAACTGGAGATCGC/gaagtgattcctccgCTATTC GTCGTAGGTGACTTCCAC)對kshB1基因進行擴增。用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ將pMV306質粒線性化,然后利用in-fusion同源重組的方法將kshA1基因連接到質粒pMV306的EcoRⅠ和HindⅢ位點之間構建得到pMV306-kshA1質粒。用限制性內切酶HindⅢ將pMV306-kshA1質粒線性化,利用in-fusion同源重組的方法將kshB1基因連接到質粒pMV306-kshA1的HindⅢ位點之后得到3-甾酮-9α-羥基化酶基因過表達質粒pMV306-kshA1-kshB1。

1.2.3 分枝桿菌電轉和陽性克隆篩選 分枝桿菌Mycobacteriumsp.TFZ電轉化感受態細胞的制作方法按照文獻[19]。將構建好的3-甾酮-9α-羥基化酶基因過表達質粒pMV306-kshA1-kshB1用電擊方法轉入Mycobacteriumsp.TFZ感受態細胞,并通過50 μg/mL的卡那霉素抗性平板進行抗性篩選,挑取單克隆。以出發菌株Mycobacteriumsp.TFZ為陰性對照,利用引物P306-kshA1-F/P306-kshB1-R進行菌落PCR,PCR產物經測序分析正確的陽性菌落即為構建的工程菌株。

1.2.4 重組菌株的生長曲線的繪制 將重組菌株劃線于固體LB培養基活化,30 ℃恒溫培養2～3 d后挑取單克隆接種于10 mL種子培養基中,30 ℃、200 r/min培養至對數后期(約48 h),得到液體種子,然后以10%體積的接種量接入50 mL種子培養基,30 ℃、200 r/min振蕩培養,每4 h取樣檢測菌液吸光度值OD600,以培養時間為橫坐標,OD600為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.5 重組菌株轉化產物組成分析 重組菌株液體種子培養方法同1.2.4,在30 mL發酵培養基中接入10%體積的液體種子,于30 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養箱培養至7 d,取樣進行HPLC檢測,分析轉化產物的組成。

1.2.6 重組菌株對植物甾醇的轉化曲線 重組菌株液體種子培養過程詳見1.2.4,在30 mL發酵培養基中接入10%體積的液體種子,放置在30 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養箱中,每24 h取樣進行HPLC檢測AD和9α-OH-AD的濃度,以發酵時間為橫坐標,分別以AD和9α-OH-AD的濃度為縱坐標,得到重組菌株轉化植物甾醇過程中AD和9α-OH-AD的濃度變化曲線。

1.2.7 發酵體系的優化

1.2.7.1 不同濃度植物甾醇對產9α-OH-AD的影響 分枝桿菌發酵培養基其他組分不變,植物甾醇投料量分別為10、15、20、25、30 g/L,每個條件設置三組平行實驗,發酵7 d后取樣檢測9α-OH-AD的濃度。

1.2.7.2 不同種類吐溫對產9α-OH-AD的影響 分枝桿菌發酵培養基其他組分不變,植物甾醇投料量為20 g/L,吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80的濃度均為4 g/L[20],每個條件設置三組平行實驗,發酵7 d后取樣檢測9α-OH-AD的濃度。

1.2.7.3 不同濃度吐溫-80對產9α-OH-AD的影響 分枝桿菌發酵培養基其他組分不變,植物甾醇投料量為20 g/L,吐溫-80的濃度分別為1、2、4、6、8、10 g/L,每個條件設置三組平行實驗,發酵7 d后取樣檢測9α-OH-AD的濃度。

1.2.7.4 不同濃度植物甾醇條件下吐溫-80對產9α-OH-AD的影響 分枝桿菌發酵培養基其他組分不變,植物甾醇投料量分別為10、15、20、25、30 g/L,對照組不加吐溫-80,實驗組添加2 g/L的吐溫-80,每個條件設置三組平行實驗,發酵7 d后取樣檢測9α-OH-AD的濃度。

1.2.8 AD和9α-OH-AD的檢測分析

1.2.8.1 樣品處理 在分枝桿菌進行甾醇發酵過程中取樣,用等量的乙酸乙酯對樣品反復萃取三次,將三次萃取液混合在一起,取50 μL萃取液蒸干,用適量的甲醇超聲溶解,經0.22 μm濾膜過濾后進行液相色譜檢測。

1.2.8.2 檢測方法 AD和9α-OH-AD具有共軛結構,在254 nm處有吸收峰,所以采用高效液相色譜的方法在254 nm下的吸收值,通過比對標準品建立的標準曲線,可以測定產物的相對含量[21]。

AD和9α-OH-AD標準曲線的繪制方法為: 分別準確稱量AD和9α-OH-AD標品各0.0500 g,用甲醇將二者溶解并定容至50 mL,配成1 g/L的標準品母液,檢測時用甲醇將其準確稀釋到濃度分別為0.100、0.080、0.060、0.040、0.020、0.010、0.005、0.001 g/L,HPLC測定其在254 nm下的吸收峰的峰面積,分別以AD和9α-OH-AD標品濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標,可以分別得到AD和9α-OH-AD的標準曲線方程。

色譜分析條件:C18反相層析柱(Agilent Extend-C18 column,4.6×250 mm,5 μm);流動相為80%甲醇:20%水(V/V),流速為0.4 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣體積為20 μL;紫外檢測波長為254 nm。

1.2.8.3 轉化產物組成成分測定 出發菌株Mycobacteriumsp.TFZ和重組菌株TFZ3215的轉化產物經HPLC檢測,產物中的AD、9α-OH-AD、22-羥基-23,24-去甲膽甾-4-烯-3-酮(4-BNA)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)、睪酮(T)和9α,22-二羥基-23,24-去甲膽甾-4-烯-3-酮(9-OH-BNA)在254 nm處均有吸收峰,通過與標準品的出峰時間相比較,由此得出各組分對應的出峰時間和峰面積[22]。根據HPLC歸一化法[23-24],將所有組分的出峰面積總和看作100%,由各組分的峰面積占總峰面積的比例,得到各個組分在轉化產物中的百分含量。

1.3 數據處理

實驗中每個處理做三次平行,采用Origin Pro 9.1軟件進行數據處理及繪圖。單因素實驗結果采用SPSS StatisticsV17.0進行顯著性分析,標有相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05),標有不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 過表達質粒的構建和重組菌株的篩選

過表達質粒的構建過程如圖1所示,以新金分枝桿菌M.neoaurumDSM 44074基因組DNA為模板,分別用引物P306-kshA1-F/R和P306-kshB1-F/R進行PCR擴增,得到目的片段kshA1(大小為1188 bp)和kshB1(大小為1029 bp),如圖2泳道1、2所示。pMV306質粒經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切線性化的片段(大小為4358 bp)如泳道3所示,pMV306-kshA1質粒經HindⅢ單酶切線性化的片段(大小為5546 bp)為pMV306質粒和目的片段kshA1長度之和(泳道4)。pMV306-kshA1-kshB1質粒經EcoRⅠ和HindⅢ酶切驗證的結果如泳道5,短條帶為目的片段kshA1,長條帶為pMV306質粒和目的片段kshB1長度之和。將pMV306-kshA1-kshB1質粒送上海杰李測序公司,以P306-kshA1-F/P306-kshB1-R引物進行測序。

圖1 過表達質粒pMV306-kshA1-kshB1的構建策略Fig.1 Construction schematic of over-expression plasmid pMV306-kshA1-kshB1

圖2 過表達質粒的電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of over-expression plasmid注:M:DNA Marker;1:目的基因kshA1條帶;2:目的基因kshB1條帶;3:pMV306質粒EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切條帶;4:pMV306-kshA1質粒HindⅢ單酶切條帶;5:pMV306-kshA1-kshB1質粒酶切驗證條帶;6:出發菌株TFZ對照;7:重組菌TFZ3215菌落PCR驗證。

挑取陽性單克隆,以引物P306-kshA1-F/P306-kshB1-R進行菌落PCR驗證,結果如泳道7所示,該片段在2200 bp左右,為kshA1和kshB1片段長度之和,經測序該片段為基因kshA1和kshB1,并且出發菌株TFZ菌落PCR結果如泳道6所示無目的條帶。由此可知,過表達質粒pMV306-kshA1-kshB1已轉入Mycobacteriumsp.TFZ菌株,得到重組菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215。

2.2 重組菌株的生長狀況

出發菌株Mycobacteriumsp.TFZ和重組菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215的生長狀況如圖3所示,出發菌株和重組菌株的生長狀況大致相同,0～9 h為滯后期,10～25 h為對數生長期,25～35 h為平穩期,之后進入衰退期。說明過表達質粒pMV306-kshA1-kshB1的轉入不會對重組菌TFZ3215的生長產生負面影響。

圖3 Mycobacterium sp.TFZ和TFZ3215生長曲線Fig.3 Growth curve of Mycobacterium sp.TFZ and TFZ3215

2.3 AD和9α-OH-AD的標準曲線方程

將8種不同濃度的AD和9α-OH-AD標品分別經HPLC檢測后,根據它們的峰面積,分別計算AD和9α-OH-AD的標準曲線方程。

9α-OH-AD標準曲線的回歸方程為:

Y=112.951X-0.006

式中:X表示9α-OH-AD的濃度,g/L;Y表示相應的峰面積,106;9α-OH-AD的濃度在0.001～0.08 g/L范圍內,相關系數r=0.99963,顯示了極好的線性關系。

AD標準曲線的回歸方程為:

Y=110.851X-0.007

式中:X表示AD的濃度,g/L;Y表示相應的峰面積,106;AD的濃度在0.001～0.08 g/L范圍內,相關系數r=0.99961,顯示了極好的線性關系。

2.4 出發菌株和重組菌株轉化產物分析

分別利用出發菌株Mycobacteriumsp.TFZ和重組菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215對植物甾醇進行生物轉化,用高效液相色譜檢測轉化產物。出發菌株TFZ轉化產物中的主要產物為AD,含量為80.1%,還有大量(約12%)的22-羥基-23,24-去甲膽甾-4-烯-3-酮(4-BNA)和少量的雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)、睪酮(T)和9α-OH-AD等副產物。重組菌株TFZ3215的轉化產物中,9α-OH-AD是主要產物,含量達到了94.7%,僅有少量的AD和9α,22-二羥基-23,24-去甲膽甾-4-烯-3-酮(9-OH-BNA)雜質,而4-BNA、ADD和T等雜質已消失。重組菌株TFZ3215與出發菌株TFZ相比,主產物由AD轉化為9-OH-AD,主要產物的純度由80.1%增加至94.7%,雜質的量也明顯減少,具有重要的工業化應用前景。

表1 Mycobacterium sp.TFZ和TFZ3215轉化產物分析Table 1 Analysis of the products of the Mycobacterium sp.TFZ and TFZ3215

2.5 重組菌株對植物甾醇的轉化

出發菌株Mycobacteriumsp.TFZ和重組菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215以植物甾醇為底物進行生物轉化,發酵液中AD和9α-OH-AD濃度的變化情況如圖4所示。出發菌株TFZ和重組菌株TFZ3215發酵過程中AD濃度的變化情況如圖4A所示,出發菌株TFZ發酵過程中AD的濃度逐漸增加,達到約3.28 g/L,而重組菌株TFZ3215發酵液中AD的積累量僅約0.12 g/L。出發菌株TFZ和重組菌株TFZ3215發酵過程中9α-OH-AD濃度的變化情況如圖4B所示,出發菌株TFZ發酵過程中僅有極少量的9α-OH-AD積累,約0.07 g/L,重組菌株TFZ3215發酵液中9α-OH-AD濃度隨著時間推移不斷增加,最終積累量達到3.43 g/L左右,9α-OH-AD的濃度是出發菌株的49倍。上述實驗結果表明:重組菌株中轉入的kshA1和kshB1基因已經成功表達,且3-甾酮-9α-羥基化酶具有極好的催化活性,可以將AD高效的轉化為9α-OH-AD。

圖4 Mycobacterium sp.TFZ和TFZ3215對植物甾醇的生物轉化Fig.4 Bioconversion of phytosterols byMycobacterium sp.TFZ and TFZ3215

2.6 重組菌株發酵體系的優化

2.6.1 植物甾醇的濃度對產9α-OH-AD的影響 為了提高重組菌TFZ3215的9α-OH-AD產量,增加發酵底物植物甾醇的投料量,測定發酵液中9α-OH-AD的積累量。如圖5所示,當植物甾醇的投料量為15 g/L時,9α-OH-AD產量增加至5.22 g/L,是植物甾醇投料量為10 g/L時的1.5倍。植物甾醇增加至20 g/L及以上時,9α-OH-AD產量反而低于植物甾醇投料量為10 g/L時,這可能是由于過高濃度的植物甾醇影響了反應體系的乳化,難以形成均勻穩定的反應體系,影響了植物甾醇的轉化,進而導致9α-OH-AD產量的減少。為了使油水體系均一穩定,可以通過添加分散劑的方法來達到穩定的轉化狀態[25]。

圖5 不同濃度植物甾醇條件下9α-OH-AD產量Fig.5 Yield of 9α-OH-AD under different concentrations of phytosterols注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；圖6～圖7同。

2.6.2 不同種類吐溫對產9α-OH-AD的影響 吐溫作為一種非離子型表面活性劑,能促進不溶于水的植物甾醇在水相中的分散,在油水轉化體系中,可以促進反應體系的乳化,從而達到均勻的狀態,促進植物甾醇的轉化。在植物甾醇的投料量為20 g/L的基礎上,添加4 g/L不同的吐溫作為表面活性劑,168 h后取樣測定9α-OH-AD產量。結果表明,添加吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60作為表面活性劑的實驗組中,9α-OH-AD產量顯著低于對照組(P<0.05),而在添加吐溫-80作為表面活性劑時,9α-OH-AD產量為5.24 g/L,9α-OH-AD的產量是對照組(2.18 g/L)的2.4倍(圖6),顯著高于對照組(P<0.05)。這說明吐溫的種類及乳化能力會影響甾醇轉化的效率,吐溫-80乳化能力比其他3種吐溫更強,主要原因可能是吐溫-80可以使菌體、油脂和植物甾醇更容易形成均勻狀態,從而有利于植物甾醇的轉化。

圖6 不同種類吐溫條件下9α-OH-AD產量Fig.6 9α-OH-AD yield under different types of Tween

2.6.3 不同濃度吐溫-80對產9α-OH-AD的影響 反應體系中吐溫-80的濃度過低,油水體系不能很好地乳化,不利于植物甾醇的轉化,而吐溫-80的濃度過高,會抑制菌體的生長,同樣影響植物甾醇的轉化,因此需要優化體系中吐溫-80的質量濃度。在植物甾醇的投料量為20 g/L的基礎上,通過在發酵液中添加不同質量濃度的吐溫-80來分析不同吐溫-80含量對9α-OH-AD產量的影響。結果表明:吐溫-80的質量濃度對9α-OH-AD產量有著顯著影響(P<0.05),當吐溫-80的質量濃度增加至2 g/L時,9α-OH-AD的產量逐漸增加至7.12 g/L,是對照組的3.3倍,當吐溫-80的質量濃度超過2 g/L后,9α-OH-AD的產量逐漸減少(圖7)。上述研究結果表明:當發酵液中吐溫-80的質量濃度為2 g/L時,能夠有效地促進反應體系的乳化,促進分枝桿菌對底物植物甾醇的轉化,提高了產物9α-OH-AD的產量。

圖7 不同濃度吐溫-80條件下9α-OH-AD產量Fig.7 Production of 9α-OH-AD at different concentrations of Tween-80

2.6.4 不同濃度植物甾醇條件下吐溫-80對9α-OH-AD產量的影響 在植物甾醇投料量為20 g/L時,2 g/L的吐溫-80可以顯著提高9α-OH-AD的產量。為了驗證在不同投料量的條件下,優化的轉化體系仍然有效,在添加2 g/L的吐溫-80的條件下,考察了植物甾醇投料量分別為10、15、20、25、30 g/L時,發酵液中9α-OH-AD的產量。研究結果表明:當植物甾醇的投料量為10、15 g/L時,與對照(無吐溫-80)相比,9α-OH-AD的產量增加較少,可能是因為植物甾醇的投料量較低,油水體系能夠達到均勻穩定的狀態,吐溫-80不是影響甾醇轉化的關鍵因素。當植物甾醇為25 g/L時,9α-OH-AD的產量為7.53 g/L,為優化前的4.4倍;而當植物甾醇的投料量為30 g/L時,9α-OH-AD的產量為5.6 g/L,是優化前的3.3倍,但是低于植物甾醇為25 g/L時的產量,這可能是由于植物甾醇的投料量過高,難以形成均一穩定的乳化體系,導致底物植物甾醇轉化率過低,從而減少了產物9α-OH-AD的產量。

圖8 2 g/L吐溫-80和不同濃度植物甾醇條件下9α-OH-AD產量Fig.8 Yield of 9α-OH-AD under 2 g/L of Tween-80 and different concentrations of phytosterols

3 結論與討論

本實驗在一株主產AD的Mycobacteriumsp.TFZ中成功表達了KSH酶,得到一株可直接轉化植物甾醇產9α-OH-AD的工程菌Mycobacteriumsp.TFZ3215,與出發菌株相比,9α-OH-AD的含量由1.7%提高到94.7%,AD的含量由80.1%減少到3.4%。在油-水雙相的發酵體系中,底物植物甾醇濃度為10 g/L時,重組菌Mycobacteriumsp.TFZ3215的9α-OH-AD產量為3.43 g/L。進一步對乳化體系進行優化,結果表明:在發酵液中添加2 g/L的吐溫-80,9α-OH-AD產量可提高到7.53 g/L,為優化前的4.4倍,顯著高于國內報道的水平[26-28]。但是構建的工程菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215在轉化植物甾醇的過程中,出現了副產物9-OH-BNA,推測該副產物來自于側鏈的不完全降解[22],因此,后續需要對工程菌株Mycobacteriumsp.TFZ3215進一步改造,從而減少副產物9-OH-BNA的生成。另外,在發酵過程中發現當植物甾醇的投料量增加至30 g/L時,9α-OH-AD產量卻低于25 g/L的植物甾醇投料量,這可能是由于植物甾醇的投料量的增加重新破壞了發酵液中的乳化體系,影響了植物甾醇的轉化。因此,應進一步優化發酵體系中植物油和植物甾醇的比例關系或篩選更加高效的乳化劑,使油水轉化體系達到更加穩定均一的狀態,提高植物甾醇的轉化率,從而進一步提高9α-OH-AD產量。