銅藻中有害元素的脫除工藝優化及脫除前后砷形態的變化

,3,3,3,*

(1.南京中醫藥大學藥學院,江蘇南京 210023;2.江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發重點實驗室,江蘇南京 210023;3.江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心,江蘇南京 210023)

海藻由于細胞壁結構特點,容易富集環境中的有害元素,且對砷元素富集最為嚴重[1-2]。自然界中的砷具有不同形態,常見的砷化合物有砷膽堿(AsC)、砷甜菜堿(AsB)、亞砷酸根(As3+)、二甲基砷酸(DMA)、一甲基砷酸(MMA)、砷酸根(As5+),砷糖(AsS)等,不同的形態具有不同的毒性,毒性大小為As3+>As5+>MMA>DMA>AsS>AsC>AsB,以無機砷毒性最大,有機砷的毒性較小,AsS、AsC、AsB則無毒[3-4]。銅藻(Sargassumhorneri)來源于褐藻門馬尾藻科,近年來在我國沿海海域上爆發,形成“金潮”災害,因此對該資源變廢為寶是海藻綜合利用的重要課題,現階段對銅藻主要集中在醫藥[5]、食品[6]、化妝品[7]、飼料[8]等行業研究。本課題前期實驗研究發現,銅藻中鉻、砷、鎘、鉛均超過GB 2762-2017《食品中污染物限量》[9]的限量規定,這將會限制銅藻的開發和利用,因此有必要脫除銅藻中的有害元素。

目前,國內外對于脫除有害元素的相關研究較多,但主要集中在水體[10]、土壤[11]、海產動物[12]等,針對海藻中有害元素脫除的問題,國內學者已經對海帶、裙帶菜、紫菜等展開研究,但以脫除銅藻中有害元素的研究未見報道。周衛松[13]采用檸檬酸脫除裙帶菜中的砷;丁仲仲[14]和周青等[15]采用檸檬酸脫除壇紫菜中的鎘。但這些研究還存在著一些不足:a.僅局限于脫除藻體中單一的有害元素,不能同時兼顧多種超標有害元素的脫除;b.沒有考慮脫除過程中藻體的功效性成分(如巖藻黃質)的損失問題;c.忽視脫除劑在藻體中的殘留。

針對目前研究存在的不足,本研究以銅藻為對象,通過對比不同脫除劑進而選擇最佳脫除劑,單因素考察料液比、浸泡時間、溫度對銅藻中鉻、砷、鎘、鉛的脫除率的影響,利用正交實驗優化脫除工藝來降低銅藻中鉻、砷、鎘、鉛含量,并采用HPLC-ICP-MS法分析脫除前后砷形態的變化,對比脫除前后巖藻黃質含量的變化,以期提高銅藻被開發利用的可能性,同時將優化后的工藝應用于不同藻類以考察該工藝的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銅藻新鮮品 采自江蘇啟東;羊棲菜新鮮品 采自浙江洞頭;馬尾藻新鮮品 采自山東威海;多元素標準溶液 國家有色金屬及電子材料分析測試中心;巖藻黃質標準品 純度≥95%，Sigma公司;65%硝酸 色譜純，國藥集團化學試劑有限公司;乙二胺四乙酸二鈉標準品、亞砷酸根(As3+)、砷酸根(As5+)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷膽堿(AsC)、砷甜菜堿(AsB) 中國計量科學研究院;乙腈、甲醇 色譜純,美國天地;檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;活性炭 中國材料院材產化工研究所。

MARS微波消解儀 美國CFM公司;NEXIOH350D電感耦合等離子體質譜儀 UHPLC Perkin Elmer;e2695高效液相色譜儀、2998PDA檢測器 美國Waters公司;STP FA2004型電子分析天平 上海上平儀器有限公司;KQ-500ED型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Milli-Q超純水機 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銅藻樣品前處理 新鮮銅藻洗去泥沙,烘干,粉碎,過40目篩即為未處理的銅藻粉末;處理后的銅藻粉末為新鮮銅藻洗去泥沙,加入洗脫劑,按照一定的料液比、溫度、時間處理后,烘干,粉碎,過40目篩,即得。

1.2.2 銅藻中有害元素的測定 按GB 5009.268-2016《食品中多元素的測定》[16]對鉻、砷、鎘、砷進行檢測。

1.2.3 最佳脫除劑的選擇 本實驗選取水[17]、EDTA-2Na[18-20]、檸檬酸[21-22]、10 g活性炭[23]作為脫除銅藻中鉻、砷、鎘、鉛的脫除劑,在料液比為1∶15 g/mL,溫度為30 ℃,時間為2 h下,考察這4種脫除劑對鉻、砷、鎘、鉛脫除率的影響,從而選擇最佳脫除劑。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 溫度對銅藻中有害元素脫除率的影響 取一定量洗去泥沙的新鮮銅藻,在時間為2 h,料液比為1∶15 g/mL條件下,考察溫度為30、40、50、60 ℃時對銅藻中鉻、砷、鎘、鉛脫除率的影響。

1.2.4.2 料液比對銅藻中有害元素脫除率的影響 取一定量洗去泥沙的新鮮銅藻,在時間為2 h,溫度為30 ℃條件下,考察料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL時對銅藻中鉻、砷、鎘、鉛脫除率的影響。

1.2.4.3 時間對銅藻中有害元素脫除率的影響 取一定量洗去泥沙的新鮮銅藻,在溫度為30 ℃,料液比為1∶15 g/mL條件下,考察時間為2、3、4、5 h時對銅藻中鉻、砷、鎘、鉛脫除率的影響。

1.2.5 正交實驗 在最佳脫除劑的選擇及單因素實驗的基礎上,對脫除料液比、溫度、時間進行正交實驗設計,因素及水平的設置見表1。

表1 正交試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 指標的計算

1.2.6.1 有害元素脫除率的計算

式中:X0、Xt分別表示未處理、處理后銅藻中鉻、砷、鎘、鉛的含量,mg/kg。

1.2.6.2 巖藻黃質含量的測定及損失率計算 取處理后及未處理的銅藻粉末于具塞錐形瓶中,加入50倍量70%乙醇,稱重,在功率500 W,溫度50 ℃,時間50 min的條件下超聲,取出,冷卻后補足減失的重量,過濾,進HPLC測定。色譜條件:色譜柱:YMC C18柱(250 mm×4.6 mm);流速1 mL/min;進樣體積:10 μL;流動相:乙腈∶水=90∶10,檢測波長:449 nm,柱溫:25 ℃。巖藻黃質的含量計算公式如下:

式中:X表示試樣中巖藻黃質的含量,mg/g;A表示試樣中巖藻黃質的峰面積;C表示巖藻黃質標品的濃度,mg/mL;V表示試樣提取體積,mL;n表示試液稀釋倍數;As表示巖藻黃質標品的峰面積;m表示樣品取樣量,g。

巖藻黃質的損失率計算公式如下:

式中:X0、Xt分別表示未處理、處理后銅藻中巖藻黃質的含量,mg/g。

1.2.7 砷形態含量測定及計算 取未處理及優化工藝條件下處理的銅藻粉末于離心管中,加入20倍量0.15 mol/L硝酸,置于90 ℃烘箱中提取2.5 h,每個0.5 h取出震蕩2 min,取出冷卻至室溫,6500 r/min離心15 min,取上清液[24],進HPLC-ICP-MS測定。色譜條件按《中國藥典(2015版)》第四部 通則2322 汞和砷元素形態及其價態測定法進行。各砷形態含量按以下公式計算:

式中:X表示試樣中各砷形態的含量,mg/kg;A表示試樣中各砷形態峰面積;C表示各砷形態標品的濃度,μg/mL;V表示試樣提取體積,mL;n表示試液稀釋倍數;As表示各砷形態標品峰面積;m表示樣品取樣量,g。

1.2.8 考察脫除工藝的適用性 分別稱取一定量的清洗后的羊棲菜、馬尾藻于燒杯中,料液比、時間、溫度為脫除工藝優化后的條件,處理后取出在50 ℃烘箱中烘干,打粉過40篩,微波消解后進ICP-MS測定有害元素脫除率。

1.3 數據處理

采用Excel 2010、GraphPad Prism 5.0、正交助手進行數據處理,所有實驗均平行三次。

2 結果與分析

2.1 銅藻中有害元素測定

表2為銅藻中有害元素鉻、砷、鎘、鉛含量,結果表明銅藻中鉻、砷、鎘、鉛分別約超出GB 2762-2017《食品污染物限量》的10倍、160倍、20倍、2倍,可見銅藻中的鉻、砷、鎘、鉛超標十分嚴重,這將限制銅藻的開發與利用。

表2 銅藻中有害元素含量測定(mg/kg)Table 2 Determination of harmful elements in Sargassum horneri(mg/kg)

2.2 最佳脫除劑的確定

EDTA-2Na是一種良好的螯合劑,能與金屬形成螯合物,GB 2760-2014《食品添加劑使用標準》[25]中規定EDTA-2Na添加量不超過250 mg/kg,課題前期發現EDTA-2Na對銅藻中鉻、砷、鎘、鉛具有較好的脫除效果,且在1.5% EDTA-2Na下殘留量低于標準限量;同時前期預實驗得出檸檬酸濃度較高時會大量降低銅藻中巖藻黃質含量,當濃度為0.5%時,銅藻中巖藻黃質的損失率少于20%,在可以接受的范圍內;因此本實驗對比1.5% EDTA-2Na、0.5%檸檬酸、水、10 g活性炭對銅藻中有害元素脫除率的影響,如圖1所示,不同脫除劑對鉻的脫除率由大到小為:10 g活性炭>1.5% EDTA-2Na>水>0.5%檸檬酸,四種脫除劑對鉻的脫除率差別不大,均為60%左右;不同脫除劑對砷的脫除率依次為:10 g活性炭>0.5%檸檬酸>1.5% EDTA-2Na>水,除水外,其他三種脫除劑對砷的脫除率均在60%上下;對于鎘的脫除率大小依次為:1.5% EDTA-2Na>0.5%檸檬酸>10 g活性炭>水,除1.5% EDTA-2Na對鎘的脫除率在80%以上外,其他脫除劑對鎘的脫除率均在20%左右;不同脫除劑對鉛的脫除率依次為:1.5% EDTA-2Na>水>10 g活性炭>0.5%檸檬酸,1.5% EDTA-2Na對于鉛的脫除率高于55%,其余均在45%以下。綜上,確定最佳脫除劑為1.5% EDTA-2Na,這與EDTA-2Na具有六個配位原子而容易和鉻、砷、鎘、鉛形成螯合物有關,與陳后山等[26]研究相似。

圖1 脫除劑對銅藻中有害元素脫除率的影響 Fig.1 Effects of removers on the removal rate of harmful elements in Sargassum horneri

2.3 單因素實驗

2.3.1 溫度的影響 不同溫度對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質損失率的影響,如圖2所示,結果表明鉻的脫除率在30～40 ℃變化趨勢小,脫除率較高;砷的脫除率變化趨勢緩慢,鉛的脫除率在40 ℃下效果最好,鎘的脫除率呈上升的趨勢,在50～60 ℃時變化不明顯,脫除效果均較好。由圖3e可知,在50～60 ℃時,巖藻黃質損失率減少,可能是溫度升高破壞銅藻中的其他成分,使得單位質量內巖藻黃質含量增加,使得巖藻黃質損失率減少。因此考慮到溫度較高可能使一些成分流失,初步確定40 ℃為脫除鉻、砷、鎘、鉛的適合溫度。

圖2 溫度對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質損失率的影響Fig.2 Effects of temperature on the removal rate of harmful elements and the fucoxanthin loss rate in Sargassum horneri注:a:鉻；b:砷;c:鎘;d:鉛;e:巖藻黃質損失率;圖3～圖4同。

2.3.2 料液比的影響 不同料液比對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質損失率的影響,如圖3所示,結果表明鉻的脫除率在1∶30 g/mL時脫除率最高,但巖藻黃質在1∶30時損失率最多,而1∶25 g/mL時鉻的脫除率次之;砷和鎘的脫除率在1∶25 g/mL時效果最好;鉛的脫除率1∶15 g/mL時最高,1∶20和1∶30 g/mL雖然脫除率較低,但鉛含量均低于國標限量。因此,初步確定1∶25 g/mL是脫除鉻、砷、鎘、鉛的適合料液比。

圖3 料液比對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質損失率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on removal rate of harmful elements and fucoxanthin loss rate in Sargassum horneri

2.3.3 時間的影響 不同時間對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質損失率的影響,如圖4所示,結果表明鉻的脫除率在5 h時最高,4 h次之,但5 h時對巖藻黃質損失率最大;砷在4 h時脫除率最高;鎘脫除率在3 h時最高,但與4 h的脫除率差別不大,鉛在各時間下均能低于標準限量;因此,初步得出4 h是脫除鉻、砷、鎘、鉛的適合時間。

圖4 時間對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質損失率的影響Fig.4 Effects of time on the removal rate of harmful elements and the fucoxanthin loss rate in Sargassum horneri

2.4 正交試驗

由表3正交實驗直觀分析表可知,影響鉻脫除率的因素由大到小依次為:料液比>時間>溫度,影響鎘脫除率的因素由大到小依次為:料液比>溫度>時間,影響砷脫除率和鉛脫除率的因素由大到小依次為:時間>料液比>溫度,溫度對于銅藻中鉻、砷、鎘、鉛的脫除率影響較小。鉻、砷、鎘、鉛的最佳脫除條件分別為A1B3C1、A2B3C3、A2B2C3、A2B2C1,對于不同有害元素其最佳脫除條件各有不同。在這四種有害元素中,砷毒性最大且砷在銅藻中超標最為嚴重,因此本研究以脫除銅藻中的砷為主,同時考慮到溫度太高會破壞銅藻中其他成分以及會使成本上漲,綜上,本實驗選擇脫除工藝為A2B3C1,即時間為4 h,料液比為1∶30 μg/mL,溫度為30 ℃。

表3 正交表實驗結果Table 3 Result of the orthogonal experiments

續表

2.5 巖藻黃質含量變化

巖藻黃質是一種存在于藻類中的類胡蘿卜素,其對光敏感,在酸性條件及高溫條件下極不穩定等[27-29],對比處理前后銅藻中的巖藻黃質含量變化,如表4所示,在時間為4 h,料液比為1∶30 g/mL,溫度30 ℃條件處理后巖藻黃質損失率為19.28%,在可以接受范圍內。

表4 脫除工藝對巖藻黃質含量的影響Table 4 Effect of removal process on the content of fucoxanthine

2.6 脫除前后砷形態含量變化

脫除工藝處理前后銅藻中不同砷形態的含量如表5所示,各砷形態提取總量約占微波消解所得總砷的75%,提取率未到100%,這可能與該前處理方法對銅藻中砷形態提取不完全有關,后續課題組將對此展開研究;還可能與銅藻中存在一些未知砷有關:如砷糖等,由于缺少相關的標品不能對其進行定性定量分析。

表5 脫除工藝前后銅藻中不同砷形態的含量(mg/kg)Table 5 Contents of different arsenic species in Sargassum horneri before and after removal process(mg/kg)

銅藻中毒性大的無機砷含量(即As3+和As5+的總量之和)最多,占各砷形態提取總量的60.26%,其次為毒性最低的AsB,占各砷形態提取總量的38.96%,DMA和MMA在銅藻中含量較低。在優化后的脫除工藝處理下,毒性較大的As3+未被檢出,As5+的含量從原有的33.83 mg/kg降至2.90 mg/kg,降低了91.43%,DMA的含量降低了34.48%,MMA含量低了37.50%。綜上說明該工藝能脫除大部分毒性較大的無機砷。

2.7 脫除工藝對不同藻類中有害元素脫除率的影響

將脫除劑為1.5% EDTA-2Na,時間為4 h,料液比為1∶30 g/mL,溫度為30 ℃的工藝應用于不同的藻類,對不同藻類中有害元素脫除率的影響如表6所示,該工藝處理后羊棲菜中鉻的脫除率為57.27%,砷的脫除率為66.00%,鎘的脫除率為87.14%,鉛的脫除率為88.88%;馬尾藻中鉻的脫除率為55.56%,砷的脫除率為56.89%,鎘的脫除率為87.14%,鉛的脫除率為96.44%。說明該脫除工藝還具有一定的適用性。

表6 脫除工藝對不同藻類中有害元素脫除率的影響Table 6 Effect of removal process on removal rate of harmful elements in different algae

3 結論

本文通過對脫除劑的選擇、單因素實驗及正交實驗優化,確定1.5% EDTA-2Na作為脫除劑,在時間為4 h,料液比為1∶30 g/mL,溫度為30 ℃時,對鉻、砷、鎘、鉛的脫除率分別為71.34%、66.32%、87.40%、87.64%,脫除后鉻、砷、鎘、鉛的含量分別為1.71、26.78、0.27、0.21 mg/kg,其中鉛的含量低于標準限量,該法對銅藻中活性成分巖藻黃質的損失率在可接受范圍,采用HPLC-ICP-MS對處理前后銅藻中的砷形態進行分析,結果表明此脫除工藝處理后銅藻中毒性較大的As3+、As5+含量分別降低100%、91.43%。將該工藝應用于羊棲菜和馬尾藻,均得到較好的脫除效果。此方法簡單,易操作,具有一定的廣泛性,可用于工業生產,適合作為將銅藻或其他藻類開發成相關產品的前期處理。

原料銅藻及其他藻類中鉻、砷、鎘、鉛超標嚴重,但其有效部位中鉻、砷、鎘、鉛的含量是否超過標準目前相關研究較少,后續課題組將圍繞脫除工藝應用于原料海藻后是否能夠降低有效部位中鉻、砷、鎘、鉛含量的研究,為銅藻的后續開發提供技術支持。