電噴霧-離子遷移譜快速檢測減肥類保健食品中非法添加的22種化學藥物

,2,*,2

(1.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院,江蘇南京 210019;2.南京中醫藥大學藥學院,江蘇南京 210023)

隨著國民生活水平的提高、人們飲食結構的改變,超重和肥胖的發病率逐日上升。由肥胖導致的糖尿病、睡眠呼吸暫停綜合癥、脂肪肝、抑郁癥、心腦血管疾病等臨床現象愈發普遍[1]。目前WHO認為肥胖是威脅人類健康的十大疾病之一[2]。一些非法商家利用部分患者減肥心切和諱疾忌醫的心理,在減肥類保健食品中非法添加某些化學藥品以達迅速療效。目前市面上減肥類保健食品中常見的非法添加物有多類[3]:食欲抑制劑(西布曲明、芬氟拉明)、能量消耗劑(麻黃堿、咖啡因)、利尿劑(呋塞米、氫氯噻嗪)、抗抑郁劑(氟西汀、安非他酮)等化學藥物,長期服用可能會產生藥物依賴性,甚至損害器官、危害健康[4]。

目前大量文獻報道了檢測保健食品中非法添加的違禁化學藥物的儀器檢測方法,包括毛細管電泳法[5]、薄層色譜與拉曼光譜法[6]、高效液相色譜法[7]、氣相色譜-質譜法[8]、高效液相色譜-串聯質譜法[9]等。這些檢測方法專屬性和準確性較高,但存在前處理操作繁瑣,對環境、設備、操作人員要求較高等問題,均不適用于保健食品非法添加的現場快速篩查,造成監督檢驗的時效性不高、支撐力不夠的局面[10]。

離子遷移譜(IMS)是上世紀70年代初發展起來的一種微量化學物質分析檢測技術,它是基于氣相中不同的氣相離子在電場中遷移速度的差異來對化學離子物質進行表征,作為快捷便利的分析手段,IMS具有小型化、易攜帶、操作簡便、響應迅速等優點[13-14],在痕量檢測中的優勢極為突出,分析時間為S級。隨著快檢車的出現,可以作為車載儀器手段加以推廣。目前,IMS已在毒品[15]、爆炸物[16]、藥品濫用[17]等方面得到廣泛應用。它可作為快篩方法用于市場監督,已有文獻報道可應用于壯陽類保健食品中非法添加的5型磷酸二酯酶抑制劑[18];改善睡眠類保健品中非法添加的巴比妥類藥物[19];抗風濕類中成藥中添加的非甾體抗炎藥[20]等。

IMS有固、液、氣多種進樣方式,何歡等[21]以63Ni作為電離源,用溶液點于試紙直接進樣的方式對減肥類保健食品進行了非法添加的篩查。本文利用電噴霧-離子遷移譜(ESI-IMS)法,對減肥類保健食品中常見的22種非法添加藥物進行分析,建立了減肥類保健食品中非法添加的現場快速篩查方法,并對40批減肥類保健食品樣品進行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

40批保健食品標示具有減肥類功效 均為市售;甲醇 HPLC級,美國Fisher公司;乙酸 HPLC級,美國Sigma Aldrich公司;氨水 HPLC級,Aladdin公司;色氨酸(純度99.9%)、檸檬酸(純度97.0%)、普羅布考(純度100.0%)、鹽酸芬氟拉明(純度99.9%)、鹽酸安非他酮(純度99.9%)、鹽酸吡格列酮(純度100.0%)、瑞格列奈(純度99.8%)、吉非羅齊(純度99.8%)、鹽酸西布曲明(純度99.9%)、鹽酸N-單去甲基西布曲明(純度94.4%)、鹽酸N,N-雙去甲基西布曲明(純度94.4%)、鹽酸氟西汀(純度99.3%)、馬來酸羅格列酮(純度99.5%)、鹽酸偽麻黃堿(純度99.8%)、鹽酸甲基安非他明(純度99.9%)、非諾貝特(純度99.9%)、吲達帕胺(純度97.7%)、比沙可啶(純度100.0%)、鹽酸二甲雙胍(純度100.0%)、酚酞(純度99.8%)、呋塞米(純度99.3%)、氫氯噻嗪(純度99.7%)、氯噻嗪(純度100.0%)、氟伐他汀鈉(純度95.5%) 以上標準品均購自中國食品藥品檢定研究院。

GA2100離子遷移譜儀 Excellims公司;AG-1620型空氣發生器 北京科普生分析科技有限公司;XP6型微量電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;十萬分之一天平 德國Satorius公司;超純水系統 美國Millipore 公司;Branson 8510超聲清洗儀 美國Branson公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 標準品溶液 稱取標準品各2.5 mg,分別置于25 mL量瓶中,用80%甲醇溶液溶解至刻度,配制成100 μg·mL-1的標準品儲備液。再用含0.5%乙酸(V/V)的80%甲醇溶液稀釋至10 μg·mL-1,作為標準品溶液I;用含0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液稀釋至10 μg·mL-1,作為標準品溶液Ⅱ。

1.2.1.2 樣品前處理 分別稱取減肥類保健食品(膠囊取其內容物,茶劑、片劑和丸劑研磨后取其粉末)0.5 g研細后置于20 mL量瓶中,用80%甲醇溶液超聲提取10 min,靜置,取其上清液過0.45 μm微孔濾膜,即得供試品儲備液。量取供試品儲備液5.00 mL,置10 mL具塞玻璃比色管,用含0.5%乙酸(V/V)的80%甲醇溶液稀釋至刻度混勻,即得正離子測定樣品儲備液;量取供試品儲備液5.00 mL,置10 mL具塞玻璃比色管,用含0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液稀釋至刻度混勻,即得負離子測定樣品儲備液。

Research on developmental and motional characteristics of Daaoxi unstable rock along

正離子/負離子測定樣品溶液:取正離子/負離子測定樣品儲備液0.200、0.500、1.00 mL置10 mL具塞玻璃比色管中,用含0.5%乙酸(V/V)/0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液稀釋至刻度,即得稀釋50倍、25倍、10倍的樣品溶液。

1.2.2 IMS儀器參數

1.2.2.1 儀器校正 進樣前用內徑為1.46 mm的注射器取校正溶液對儀器進行校正(色氨酸校正時間為10.210 ms;檸檬酸校正時間為8.606 ms)。校正完后取待測溶液適量(30～50 μL)進樣分析。

1.2.2.2 IMS 檢測條件 正離子模式下源電壓2200 V;負離子模式下源電壓1800 V。兩種模式下,進氣口溫度均為180 ℃;遷移管電壓8000 V,遷移管溫度180 ℃;離子柵門電壓45 V,脈沖寬度120 μs;進樣速度1.2 μL·min-1。

1.3 數據處理

以遷移時間(ms)為橫坐標,強度為縱坐標繪制離子遷移譜圖譜,記錄各化合物遷移峰的遷移時間和強度。

2 結果與分析

2.1 條件的選擇和優化

2.1.1 IMS條件的選擇和優化 比較了源電壓(1600～2600 V)對測定結果的影響。結果表明,改變源電壓,遷移時間不會發生改變,但會影響物質的相對響應。22種化合物響應值隨源電壓變化的關系如圖1(圖1a為負離子模式;圖1b～1d為正離子模式)所示。綜合考慮,正離子模式下選取2200 V作為源電壓,負離子模式下選取1800 V作為源電壓。同時也對遷移管電壓(7500～8500 V)、門電壓、門寬度等參數進行了探究,發現當遷移管電壓為8000 V時峰型和分離度最好;改變門電壓和門寬度時,結果變化不明顯。

圖1 不同源電壓對目標物響應值的影響Fig.1 The effect of response values of 22 kinds of compounds at different source voltages注:a為負離子模式;b～d為正離子模式。

2.1.2 檢測模式和遷移時間 在上述優化條件下,將1.2.1.1中標準品溶液I、Ⅱ進行了正負離子模式測驗,結果表明,18種物質在正離子模式下有響應,4種物質在負離子模式下有響應,各物質譜圖見圖2。遷移時間和約化遷移率K0(cm2·V-1·s-1)結果見表1。K0可根據如下公式[15]算出。根據公式,當儀器工作參數一定時,約化遷移率K0只與遷移時間td有關。

表1 22種化合物的IMS特性(n=5)Table 1 IMS characteristics of 22 compounds(n=5)

圖2 22種標準品溶液的IMS圖譜Fig.2 IMS spectrograms of 22 standard solutions

其中:L(cm)為遷移管長度;P(inHg)為遷移管壓強;td(s)為遷移時間;U(V)表示遷移管電壓;Td(K)表示遷移管溫度。

2.1.3 提取溶劑的選擇和優化 根據IMS原理,溶液中水和有機溶劑的比例會影響溶劑蒸發效率和電噴霧離子帶電效率,進而影響物質響應。因此,本研究比較了各目標化合物在不同比例甲醇溶液(60%、70%、80%、90%、100%)中的響應情況。結果顯示,在80%的甲醇溶液中基線較平,響應較高,因此選用80%甲醇溶液作為提取溶劑。

在正離子模式下,比較了待測溶劑加酸和不加酸的測定結果,結果發現在溶劑中加入適量酸會提高響應值,負離子模式加適量氨水可以提高響應;通過比較甲酸和乙酸,以及0.2%、0.5%、1%、2%的不同酸/堿濃度,可以看出加乙酸比加甲酸基線稍平、響應略好。在加入0.5%的乙酸(ESI+)和0.5%的氨水(ESI-)情況下,目標物的響應最佳。因此,最終確定正離子模式下制備溶劑為含0.5%乙酸(V/V)的80%甲醇溶液;負離子模式下制備溶劑為含0.5%氨水(V/V)的80%甲醇溶液。

2.2 樣品稀釋方法的選擇

一方面,由于非法添加的化合物往往具有較高濃度,且離子遷移管有一定的記憶效應[13],實驗發現長時間使用,儀器響應會降低,需要拆機清洗,故本試驗選用將樣品儲備液稀釋不同倍數,從低濃度樣品開始采集數據;另一方面,由于減肥類保健食品常見為減肥膠囊、減肥茶,輔料較多,易存在一定的基質效應,為了預防假陰性的產生,選擇將樣品儲備液稀釋50、25、10倍,較文獻[13]稀釋得少。這樣既能減小記憶效應,預防離子源的污染,又兼顧靈敏度。

2.3 專屬性考察

選取該實驗40批減肥類保健食品中,用液相色譜法未檢出非法添加的37批陰性樣品,進行IMS分析,未發現在22個減肥類藥物出峰的位置出現干擾峰;3批陽性樣品均檢出相應的非法添加物,表明方法專屬性良好。

2.4 基質效應和靈敏度的考察

由于保健食品基質的存在,基質中存在的離子未經過色譜分離直接進入離子遷移譜的電噴霧離子源易出現基質效應[22]。實驗發現,樣品基質對離子遷移譜測定22種減肥類化合物的干擾主要為基質抑制效應,且不同化合物在不同基質中差異較大。以鹽酸西布曲明(正離子模式)和呋塞米(負離子模式)為例,膠囊、茶劑、片劑陰性樣品各選一批,按照1.2.1.2制備稀釋10、25、50倍的樣品溶液,進行基質加標,西布曲明的峰高強度約為標準品溶液的75%～105%,而呋塞米約為20%～70%,而峰寬和遷移時間的SD值與對照品沒有顯著性差異。

故檢出限的判定使用基質加標法,選擇膠囊、茶劑、片劑陰性樣品各一批,按照1.2.1.2的前處理方法操作,得到空白基質溶液(樣品儲備液稀釋50倍)。吸取一定量1.2.1.1的各標準品溶液,用空白基質溶液對該液逐級稀釋,以信噪比(S/N)為3時的檢出濃度作為檢出限(LOD),選擇檢出限最差的結果作為該物質的檢出限,見表1。

由于鹽酸甲基安非他明和鹽酸二甲雙胍的遷移時間與樣品溶劑峰遷移時間較接近,因此在少量濃度時,目標化合物的峰會混于樣品溶劑峰里不易區分;只有當目標化合物達到一定濃度,其峰的響應值大于溶劑峰響應值時,才會于溶劑峰中凸顯出來(圖3),因此原本在單一對照中響應較好的安非他明和二甲雙胍在基質匹配溶液中檢出限都略高,均為1.5 mg/L;負離子模式下的呋塞米、氫氯噻嗪、氯噻嗪、氟伐他汀鈉由于基質抑制效應較強,所以檢出限濃度也較大,呋塞米檢出限為8 mg/L,氫氯噻嗪為3 mg/L,氯噻嗪、氟伐他汀鈉為5 mg/L。但由于實際樣品中非法添加含量一般較高,甚至可達g/L,因此該類物質的檢出限足以能判斷是否有非法添加物。

圖3 樣品基質中二甲雙胍(a)和甲基安非他明(b)檢出限測定的IMS圖Fig.3 IMS image of detection limit of metformin and methamphetamine in sample matrix

2.5 實際樣品的測定和譜庫的建立

儀器軟件自帶譜庫建立和檢索功能,可以在譜庫中添加化合物名稱和校正后的離子遷移譜信息并保存,直接用于同種型號、同種測定條件下不同儀器之間的數據比較,實現數據共享,特別適合用于進行現場非法添加物質的篩查。

取1.2.1.2中配制的不同稀釋倍數的樣品溶液,按稀釋倍數50、25、10倍的順序分別在正負離子模式下測定。結果發現,有3批樣品除溶劑峰外,稀釋50倍即有明顯的非法添加峰:正離子模式下有1批(膠囊1)在12.205 ms處檢測出非法添加物,與已建譜庫核對,疑似非法添加物為西布曲明或吉非羅齊;正離子模式下有1批(膠囊2)在12.360 ms處檢測出非法添加物,與已建譜庫核對,疑似非法添加物為酚酞;正離子模式下有1批(膠囊3)在12.744 ms處檢測出非法添加物,與已建譜庫核對,疑似非法添加物為氟西汀。采用實驗室已建立的HPLC-IT-TOF法的測定上述樣品,結果膠囊2和膠囊3確檢出酚酞和氟西汀,如圖4所示;而膠囊1除了檢出鹽酸西布曲明,與離子遷移譜測定結果一致以外,還有少量的酚酞,初篩(稀釋50倍)被忽略了。重新同時測定稀釋50、25、10倍的樣品溶液,如圖5所示,依然不能判斷出含有酚酞,可能是由于2種物質峰位接近,鹽酸西布曲明的比酚酞量大且靈敏度高,淹沒了酚酞的信號。其余37批樣品未檢出與文中所列標準品一致的色譜峰,與離子遷移譜測定結果一致。

圖4 膠囊2和膠囊3的IMS圖(正離子模式)Fig.4 IMS diagram of capsule 2 and 3(positive ion mode)

圖5 膠囊1的IMS圖(正離子模式)Fig.5 IMS diagram of capsule 1(positive ion mode)

3 討論與結論

保健食品中非法添加現象屢禁不止,而以非法添加為目的的專項抽查需要有針對性,以免浪費實驗室資源,本研究針對22種減肥類非法添加物質,建立了一種快速、高效的電噴霧-離子遷移譜檢測方法,目的在于現場抽樣時的快速篩查。相比于體積龐大、操作繁瑣,受限于實驗室操作的LC-MS等常用分析設備,以及化學試劑盒種類繁多,結果時效性短,判斷誤差大,建立的離子遷移譜法操作簡單、檢測時間短。在實際樣品測定時,只需對待測樣品進行簡單的溶劑提取,即可在1 min內完成檢測;在數據分析時,可直接利用已建譜庫進行非法添加物的篩查,不必再配備標準品進行對照,結果較現有的化學試劑盒、薄層色譜法等現場篩查法更快速,通用性、穩定性和耐用性更好。盡管離子遷移譜有許多優點,但也存有不足之處。首先,離子遷移譜主要是靠遷移時間來對化合物進行定性,在準確定量方面必然不能與目前標準的LC-MS方法相比;其次,定性參數遷移時間的分析窗口較窄,當一些同種類非法添加物遷移時間太過接近時會不易區分;再次,樣品基質中有些難以判斷的基質干擾峰,可能出現假陽性。但是,現場初篩并不是最終判定手段,盡可能避免假陰性,允許一定假陽性的出現,雖然減肥類保健食品基質繁多,但是某個遷移峰明顯,即說明某些物質物質含量很高,且有與譜庫相符的異常峰出現,無論添加物為A或B,即可初步判定該樣品為問題樣品,抽樣后待實驗室進一步確證。因此,離子遷移譜作為初篩工具,其更適用于現場快速篩查,可大大縮短現場檢測時間、提高效率,為監管決策部門提供技術保障和執法依據。