何首烏飲片顏色-成分-活性快速無損評價

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(1.廣東藥科大學中藥學院,廣東廣州 511400;2.國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室,廣東廣州 511400)

何首烏別名首烏、赤首烏,是蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb的干燥塊根[1],其藥用初載于《開寶本草》,歸肝、心、腎經。依據炮制方法的不同,可分為生何首烏和制何首烏,其功效有所不同:生何首烏通便、消癰腫、解瘡毒;制何首烏可補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨[1]。作為傳統的藥食兩用藥材,在衛生部公布的《關于進一步規范保健食品原料管理的通知》中,制何首烏入選《可用于保健食品的物品名單》。何首烏市場發展潛力巨大,有效區分和快速辨別何首烏的生熟及炮制程度,對何首烏進一步開發利用具有指導意義。

用于何首烏質量和炮制程度的評價方法主要有化學成分分析[2-4]、體內外活性研究[5-8]等。常用的分析方法有TLC、HPLC含量測定[9-10]和指紋圖譜[11-12]等,均需較繁瑣的樣品前步驟。近年來,以仿生技術為代表的中藥快速分析技術以其操作簡便、無損樣品以及快速分析等優勢得到了快速發展[13]?，F代仿生技術主要包括電子鼻、電子舌和電子眼,其中電子眼,即色差計,特別適用于食品[14]和藥物[15]在炮制方面的色澤量化。

顏色是區別制何首烏和生何首烏的重要指標,顏色變化能在一定程度上表征飲片中化學成分的轉化,測定顏色值可避免化學成分測定受限以及單一成分無法判斷藥材整體質量的問題。二苯乙烯苷類、蒽醌類、磷脂類、多糖是何首烏中主要化學成分[16-18],在炮制加熱過程中,結合蒽醌逐漸轉變為游離蒽醌類[19-20],多糖分解成還原糖進而引發美拉德反應(Millard reaction)導致藥材顏色變化[21-22];而二苯乙烯苷類等其他成分,與何首烏飲片顏色變化相關性不強,不入選本研究的測定指標。

鑒于目前對何首烏炮制程度的評價缺乏快速直觀的標準化檢測方法,本文以廣東德慶道地產區何首烏為研究對象,采用色差計對何首烏粉末顏色進行客觀的量化分析,以何首烏顏色值、游離總多糖和總蒽醌為指標,評價其質量?，F代研究表明,肝臟是何首烏的敏感器官,因此本研究還探討了不同炮制程度何首烏對體外培養的肝細胞增殖的影響。通過何首烏飲片顏色、成分含量及與體外細胞活性的相關性分析,評價何首烏的炮制程度,實現中藥何首烏炮制品快速無損評價的客觀化和數字化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

何首烏飲片 購于廣東德慶,由廣東藥科大學李書淵教授鑒定為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb)干燥塊根;D-無水葡萄糖對照品(批號:10833-200503)、1,8-二羥基蒽醌對照品(批號:CHB180224)、醋酸鎂 天津市致遠化學試劑有限公司;HepG2細胞系 CC0101,購自廣州賽庫公司,在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中,于37 ℃ 5% CO2進行常規培養,實驗均在細胞生長對數期進行;DMEM高糖培養基 賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司。

MJ-78A全自動高壓蒸汽滅菌鍋 上海飛迪生物科技公司;SQP十萬分之一天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司;CR-410色差計 日本柯尼卡美能達公司;UV-2600紫外可見分光光度計 日本島津公司;ELX800酶標儀 BioTek Instruments。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同何首烏樣品的制備 按2015版《中國藥典》[1]通則0213制備何首烏飲片炮制品。取蒸餾水潤透何首烏飲片于高壓蒸汽滅菌鍋內,溫度設置為120 ℃,蒸制30 min,壓力為0.15 MPa,取出,稍晾,翻拌至汁液吸凈,置電熱鼓風干燥箱40 ℃干燥10 h。重復蒸制干燥步驟,制備不同炮制次數何首烏飲片,標記為P0～P9(其中P0(Processed zero)表示為何首烏生品,P1表示為炮制一次的何首烏,以此類推)。

精密稱取何首烏飲片P0～P9各30 g,以300 mL水煎煮2次,每次1.5 h,濾過,合并濾液,于100 ℃下濃縮至10 mL(原體積的1/60),得1 g/mL(生藥濃度)水提液,以硫酸-苯酚顯色法測總多糖含量,MTT法測細胞增殖率的影響。

分別精密稱取何首烏飲片P0、P3、P6、P9各30 g,以300 mL 95%乙醇回流提取,同法得到醇提液,以醋酸鎂甲醇顯色法測總蒽醌含量,MTT法測細胞增殖率的影響。

1.2.2 顏色值的測定 取約30 g何首烏樣品粉碎,過65目篩得到何首烏細粉。取約2.5 g何首烏細粉于石英樣品杯輕輕振搖使分布均勻,以積分球漫反射法重復測量3次,取平均數。色差計測定條件為光源D65,標準觀察角2度,照明口徑50 mm,分辨分辨率8 cm-1,掃描次數64次,溫度(25±2) ℃,相對濕度45%～50%。以顏色明度值L*、紅綠色值a*、黃藍色值b*、總色值E*ab進行色澤量化[23]。

1.2.3 何首烏炮制過程中化學成分的測定

1.2.3.1 總多糖含量的測定 精密稱取葡萄糖標準品5.02 mg,加水制成0.01004 mg/mL葡萄糖標準品溶液儲備液,備用。取1 mL水提液,稀釋,作為何首烏水提供試品溶液,備用。

準確吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.7、0.8 mL標準品溶液,分別加入純水至1.0 mL,迅速加入顯色劑(1 mL 5%苯酚水溶液和5 mL濃硫酸),60 ℃水浴30 min,冰浴30 min,置于紫外可見分光光度計于486.5 nm處測其吸光度[24]。

精密稱取水提液1 mL,按照上述方法顯色后,以濃硫酸苯酚溶液為空白對照,用紫外可見分光光度計在486.5 nm下測其吸光度,計算總多糖含量和相對質量分數。

1.2.3.2 游離總蒽醌含量的測定 精密稱取1,8-二羥基蒽醌標準品4.36 mg,加0.2%的醋酸鎂甲醇溶解制成0.436 mg/mL的1,8-二羥基蒽醌標準品溶液儲備液,備用。取1 mL何首烏醇提液,加0.2%醋酸鎂甲醇溶液稀釋,作為何首烏醇提供試品溶液,備用。

準確吸取1,8-二羥基蒽醌標準溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.60、0.80 mL分別置于5 mL容量瓶中,加入0.2%醋酸鎂甲醇定容搖勻。以0.2%醋酸鎂甲醇作為空白對照溶液,在511 nm處測其吸光度[25]。

精密稱取何首烏醇提供試品溶液1 mL,按上述方法顯色,以醋酸鎂溶液為空白對照,置紫外可見分光光度計于511 nm下測定,計算游離總蒽醌含量和相對質量分數。

總蒽醌相對質量分數(%)=制何首烏總蒽醌含量/生何首烏總蒽醌含量×100

1.2.4 何首烏提取液對細胞體外增殖活性影響 取1.2.1得到的水提液,分別用DMEM高糖培養基稀釋成生藥濃度為10、1 mg/mL,用0.22 μm微孔濾器除菌。

將消化下來的細胞按2×105cell/mL接種于96孔培養板,每孔200 μL,每組設5個復孔。培養24 h后,棄去培養基,加入配好的何首烏水提液200 μL,培養24 h后棄去藥液,加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,孵育4 h,棄去MTT溶液,加DMSO 150 μL震搖15 min,置酶標儀490 nm下測定,計算細胞增殖率,應用GraphPad Prism 5軟件進行數據處理。

用DMEM高糖培養基將得到的何首烏醇提液稀釋成生藥濃度為12.5 mg/mL,用0.22 μm微孔濾器除菌。將消化下來的細胞按2×105cell/mL接種于96孔培養板,每孔200 μL,每組設5個復孔。培養24 h后,棄去培養基,加入配好的何首烏醇提液200 μL,分別培養24、48 h。檢測步驟同上所述。

1.3 數據處理

利用SPSS 21.0軟件做統計描述和相關性分析,采用GraphPad Prism 5作圖,用SIMCA-P 14.0軟件進行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和偏最小二乘回歸分析(PLS)等數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 總多糖的線性線性范圍及含量測定

以葡萄糖對照溶液濃度為橫坐標(c,mg/mL),以吸光度為縱坐標(A),得回歸方程為:Y=9.2001X-0.013(R2=0.9994),結果表明,葡萄糖終濃度在0.0014～0.0115 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。何首烏飲片P0～P9水提液總多糖含量測定結果見表1。炮制會引起何首烏多糖含量的變化:生何首烏多糖含量最低,只有0.343%;在炮制零次～炮制六次期間,多糖含量總體呈現較快的上升趨勢,在炮制六次～炮制八次時增長速率達到平臺期,此時,多糖含量達到最大,在0.783%～0.792%之間,與生首烏相比,此時多糖含量上升了2.3倍左右。何首烏在第九次炮制時,多糖含量出現下降的情況,這可能是還原糖轉化為類黑精或揮發性成分所致[26]。

表1 何首烏飲片顏色值及化學成分含量Table 1 Color determination and chemical components contents of Polygonum multiflorum Thunb

2.2 游離總蒽醌的線性線性范圍及含量測定

以1,8-二羥基蒽醌對照溶液濃度為橫坐標(c,mg/mL),以吸光度為縱坐標(A),得回歸方程為:Y=37.305X-0.01(R2=0.9993),結果表明,1,8-二羥基蒽醌在0.0005～0.0174 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。何首烏飲片P0、P3、P6、P9醇提液總游離蒽醌含量測定結果見表1。炮制也會引起藥材總蒽醌含量的變化,蒽醌含量為P9>P6>P3>P0,說明游離蒽醌含量也隨著炮制次數的增加而變化(見圖1),這可能是由于何首烏在高溫炮制過程中結合蒽醌水解成游離蒽醌[27]。

圖1 何首烏炮制過程中多糖、總蒽醌含量的相對質量分數Fig.1 Relative content variation of total polysaccharide and total anthraquinone in processing of Polygonum multiflorum Thunb

2.3 樣品顏色值測定數據

L*表示明度值,L*值越大越白,反之則越黑;a*表示紅綠色值,a*值越大越紅,反之則越綠;b*表示黃藍色值,b*值越大越黃,反之則越藍[28]。在D65光源下,色差值L*介于33.76～44.26之間,a*介于3.28～4.75之間,b*介于0.93～8.27之間;相較生品,何首烏在高壓清蒸炮制過程中,樣品色差值L*、a*、b*、E*ab均呈下降趨勢,表明何首烏在炮制過程中亮度變暗,偏綠、藍色澤。何首烏炮制樣品較生品顏色深,可能是由于在高壓炮制過程中何首烏多糖類成分和氨基酸發生了美拉德反應,使何首烏發生了由黃色轉呈黑褐色的非酶促褐變過程[29]。

2.4 何首烏提取液對細胞體外增殖活性影響

水提液對細胞增殖有顯著促進作用(圖2),醇提液對細胞增殖活性無影響(圖3)。何首烏提取液不同濃度、不同作用時間對體外細胞增殖活性結果見表2。

表2 何首烏提取液對細胞增殖的影響(%,n=5)Table 2 Effects of Polygonum multiflorum Thunb extracts on cell proliferation rate(%,n=5)

圖2 何首烏水提液對細胞增殖的影響Fig.2 Effects of Polygonum multiflorum Thunb water extract on cell proliferation rate

圖3 何首烏醇提液對細胞增殖的影響Fig.3 Effects of Polygonum multiflorum Thunb ethanol extract on cell proliferation rate

何首烏水提液對細胞增殖存在顯著促進作用(P<0.05),各不同炮制階段(P7除外)的MTT結果比較發現,高濃度組(10 mg/mL)細胞增殖率高于低濃度組(1 mg/mL)。在低濃度組,炮制的何首烏細胞增殖率增長速度呈先上升再下降的趨勢,何首烏在炮制七次時,細胞增殖率最高,達153.14%;在高濃度組,細胞增殖率在135.53%～150.67%之間,均能顯著促進細胞增殖,說明何首烏水提液高濃度組體外活性更好。

預實驗結果表明,不同濃度何首烏醇提液對細胞體外增殖率在102.27%～122.53%之間,均無顯著性影響,故選用較高濃度(12.5 mg/mL)何首烏醇提液分別給藥24和48 h檢測細胞增殖活性的影響。因此,何首烏醇提液體外活性實驗結果不作為活性相關性分析的數據來源。

2.5 何首烏炮制品顏色-成分含量的相關性分析

分別以總多糖、總蒽醌含量為因變量,以色差值L*、a*、b*、E*ab為自變量,利用SPSS 21.0軟件進行相關性分析,結果見表3。游離總多糖含量與L*、b*和E*ab值在0.05水平上存在顯著的負相關關系,游離總蒽醌含量與色差值a*在0.01水平上存在顯著的負相關關系,即在一定程度上,炮制次數越高,色差值越小,何首烏中總多糖和總蒽醌含量越高。對SPSS 21.0軟件進行回歸分析,得回歸方程:Y(總多糖含量)=1.362-0.013L*-0.032a*-0.036b*,可通過何首烏炮制的顏色值快速預測總多糖含量。

表3 化學成分含量與顏色的相關性分析(n=10)Table 3 Pearson correlation analysis of apparent color and chemical components(n=10)

2.6 何首烏炮制品顏色-成分-活性的關聯分析

以何首烏游離總多糖含量,色差值L*、a*、b*、E*ab和細胞增殖活性為變量,用Simcap 14.1軟件進行主成分分析(PCA),結果見圖4。分析結果顯示,以顏色值和總多糖為變量時,可將9批不同程度的何首烏炮制飲片分為3組,即炮制一次到炮制三次為一組,炮制四次到炮制五次為一組,炮制六次到炮制九次為一組。以PCA的結果對細胞增殖率建立偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)模型(如圖5)對何首烏飲片的分組更為細致,可將9批不同程度的何首烏炮制飲片分為5組,從分組可知炮制六次和炮制九次為歸為一組,推測可能是炮制到某個程度后,何首烏的量效到達一定閾值,再增加炮制次數并不能提高何首烏飲片多糖含量及體外細胞增殖率,甚至出現下降的趨勢,因此可認為何首烏高壓清蒸的最佳炮制程度為炮制六次到炮制八次。通過PLS建立了何首烏飲片細胞活性與顏色值、游離總多糖偏最小二乘回歸模型:Y=0.434X1-0.239X2+0.317X3+0.235X4(Y為細胞活性,X1～X4分別為色差值L*、色差值a*、色差值b*、游離總多糖含量)。由本模型結合數據分析可知,何首烏飲片炮制一次到炮制八次后其Y值介于14.7～17.2之間,而生何首烏和九次炮制何首烏的Y值分別是19.9、14.3;結合表1、表2數據得,Y值14.7～17.2數據區間何首烏多糖含量較高,細胞活性較好。由此可知,該模型可通過代入何首烏炮制品的顏色值和游離總多糖含量快速預測其細胞增殖活性,評估何首烏的等級。

R2×[1]=0.367 R2×[2]=0.106Ellipse:Hotelling’s T2(95%)圖4 顏色-游離總多糖PCA分布圖Fig.4 Scatter score plot of PCA of color-total polysaccharide-viability

R2×[1]=0.340 R2×[2]=0.122Ellipse:Hotelling’s T2(95%)圖5 顏色-游離總多糖-活性PLS-DA分布圖Fig.5 Scatter score plot of PLS-DA of color-total polysaccharide-viability

3 討論

何首烏是我國一種傳統常用中藥材,也是食療保健之佳品。何首烏含有15種氨基酸、豐富的無機營養元素、9種維生素和13種苷磷脂等[30],有較高的營養價值。何首烏生熟異用,快速辨別何首烏的炮制程度,對其資源的綜合利用、完善質量評價等具有重要意義。

本文應用色差計對不同炮制批次何首烏飲片進行辨色,實現何首烏飲片傳統性狀的量化描述(L*,a*,b*);采用分光光度法測定何首烏飲片提取液中游離總多糖含量和游離蒽醌含量。對何首烏外觀顏色與內在化學成分進行相關性研究,發現色差值L*、b*、E*ab與總多糖含量存在顯著的負相關關系,a*與總蒽醌含量存在顯著的負相關關系,即隨著顏色的加深(總色差值E*ab降低),總多糖呈先明顯上升后穩定的趨勢,而總蒽醌含量呈上升趨勢。對何首烏顏色-總多糖-活性進行PLS-DA分析,結果發現炮制到一定程度后,何首烏飲片六制和九制的顏色-總多糖-活性相重疊,炮制達到第九次時,何首烏飲片的體外活性及化學成分呈現下降趨勢,據此推斷何首烏高壓炮制的最佳次數為六次～八次。

鑒于何首烏炮制品內在質量存在較大差異的現狀,本實驗基于“表里關聯”思路,將何首烏外觀顏色與游離總多糖和總蒽醌含量及對細胞增殖作用的強弱相關聯,建立PLS偏最小二乘回歸模型,對何首烏炮制程度進行分組,為常用中藥何首烏快速無損質量評價提供參考,為中藥炮制過程監控及質量控制研究提供新思路。