抑制細胞周期蛋白依賴性激酶8表達對小鼠胰島β細胞增殖及胰島素分泌功能的影響觀察

張艷，王晨菲，王思瑤，羅荔

新疆醫科大學第五附屬醫院，烏魯木齊830011

糖尿病是一種代謝紊亂的慢性疾病，我國成人糖尿病的發病率逐年上升[1]。糖尿病的直接誘因是胰島素分泌不足[2]。胰島β細胞的數量減少與功能障礙均可導致胰島素分泌不足[3]，因此胰島β 細胞的數量減少貫穿于整個糖尿病發病的過程[4,5]。細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是一類多功能激酶，可調控細胞周期各環節的起始與進程，在細胞增殖、分化中發揮調控作用[6]。CDK的活性失調與多種腫瘤的發生、發展有關。作為新的治療靶點，CDK抑制劑的研究成為目前抗腫瘤藥物研究的熱點[7]。近年來，CDK在胰島β細胞的損傷以及胰島素分泌中的作用越來越受到關注。CDK可參與胰島β細胞的各種代謝過程，如抑制CDK4表達的小鼠胰島β細胞中Kir6.2基因表達下降，胰島素分泌功能受損和葡萄糖不耐癥，促進糖尿病的發生、發展[8]。具有胰島β細胞特異性遺傳缺失CDK2小鼠線粒體功能受損、胰島素分泌降低，可導致小鼠對葡萄糖耐量降低[9]。但CDK4在糖尿病發生發展中的具體作用機制目前尚不明確。2019年5月～2020年1月，我們觀察了抑制CDK8表達的胰島β細胞的增殖及胰島素分泌情況，探討其可能作用機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 MIN6小鼠胰島β細胞株購于美國菌種保藏中心ATCC。本試驗所用主要試劑包括：胎牛血清(德國PAN-Biotech公司)，β-巰基乙醇、鏈霉素、青霉素、DMEM培養基(美國Sigma-Aldrich公司)，CCK8試劑盒、胰島素分泌測定ELISA試劑盒(美國Invitrogen公司)，TRIpureReagent試劑(北京艾德萊生物科技有限公司)，Prime ScriptTM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM II(日本Takara公司)，RIPA裂解液、BCA蛋白測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，抗人CDK8 單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，兔抗人GAPDH、Cyclin D1、PCNA、PPARγ抗體(英國Abcam公司)。CDK8 siRNA 重組慢病毒(可抑制CDK8表達)與siRNA-NC慢病毒(陰性對照)由上海吉滿生物科技有限公司構建。

1.2 細胞分組及CDK8 siRNA轉染方法 將MIN6細胞加入含15%胎牛血清、2.5 mM β-巰基乙醇、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養基中，37 ℃、5% CO2培養。待細胞融合度80%～90%時，棄去培養基，無菌PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化5 min，傳代培養。將培養細胞接種到12孔細胞培養板內，分為3組，每組6個復孔?？瞻捉M不給予任何干預，陰性組轉染siRNA-NC慢病毒液，觀察組轉染siRNA-CDK8慢病毒液，方法為用含5 μg/mL Polybrene的新鮮培養基稀釋慢病毒原液，將慢病毒液添加到培養孔中，每孔1 μg/mL，37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養48 h，棄病毒液，加入完全培養液培養48 h備用。

1.3 各組細胞增殖情況觀察 采用CCK8法。取各組細胞，1×105/孔接種到96孔板內，每組12個復孔，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。分別于培養24、48、72 h時，取各組細胞，每孔中添加10 μL的CCK8工作液，繼續培養2 h，按照CCK-8試劑盒說明進行操作，在酶標儀上450 nm處檢測各孔細胞的光密度OD值，以OD值代表各組細胞增殖活性。

1.4 各組細胞周期分布觀察 采用流式細胞儀。取各組細胞，PBS洗滌2次，預冷的75%乙醇重懸細胞，-20 ℃下固定24 h，棄乙醇，PBS洗滌2次重懸，每組取450 μL細胞懸液，加入2 μL的 RNase，37 ℃孵育10 min，加入500 μL碘化丙啶，37 ℃避光孵育30 min，過300 目篩網，流式細胞儀檢測各組細胞周期分布。

1.5 各組細胞上清液胰島素檢測 采用ELISA法檢測胰島素水平。取各組細胞，棄原有培養基，加入500 μL無糖KRBH溶液，37 ℃孵育1 h，棄無糖 KRBH 溶液，分別換用500 μL含5 mmol/L、 20 mmol/L Glucose的KRBH 溶液，37 ℃孵育 1 h，4 ℃離心 20 min，收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明檢測各組細胞上清液胰島素。重復3次，取平均值。

1.6 各組細胞CDK8、胰島素合成相關轉錄因子(PDX1、INS2和MAFA)、胰島素轉運相關因子GLUT2 mRNA檢測 采用熒光定量PCR法。取各組細胞，根據TRIpureReagent試劑說明提取總RNA，核酸蛋白檢測儀Nanodrop測定RNA濃度和純度。按照Prime ScriptTM RT reagent Kit說明書進行逆轉錄操作獲得cDNA，根據SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書進行擴增。反應體系為：上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 2 μL、SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5 μL、無酶水補足25 μL。擴增條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 45s，40個循環。以GAPDH 作為內參，以2-ΔΔCt代表目的 mRNA相對表達量。引物由上海吉滿生物科技有限公司合成，具體引物序列見表1。

表1 qRT-PCR法各基因引物序列表

1.6 各組細胞CDK8、細胞周期蛋白(Cyclin)、過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ)、增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白檢測 采用Western blotting法。采用RIPA裂解液抽提各組MIN6細胞總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。以每孔30 μg上樣進行10%SDS-PAGE電泳，分離的蛋白切膠并轉移至PVDF膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別添加兔抗人 CDK8 單克隆抗體(1∶10 000)、GAPDH(1∶5 000)、Cyclin D1(1∶10 000)、PCNA(1∶1 000)、PPARγ(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，次日使用TBST漂洗，并加入辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗(1∶2 000)，再次TBST漂洗，在暗室用ECL發光液檢測，Bio-Rad凝膠成像系統顯影，用ProtParam軟件對灰度值進行分析。以目的蛋白灰度值與內參GAPDH蛋白灰度值之比為最終目的蛋白的相對表達量。重復3次,取平均值。

2 結果

2.1 各組細胞增殖活性比較 培養24 h時，觀察組、對照組及空白組細增殖活性分別為0.38±0.02、0.40±0.03、0.41±0.04，培養48 h時，觀察組、對照組及空白組細增殖活性分別為0.55±0.06、0.64±0.06、0.66±0.07，培養72 h時，觀察組、對照組及空白組細增殖活性分別為0.72±0.07、1.24±0.11、1.30±0.13，培養24、48、72 h時，與空白組及對照比較，觀察組細胞增殖活性降低(P均<0.05)。

2.2 各組細胞周期分布比例比較 觀察組、對照組及空白組G0/G1期細胞比例分別為60.58%±1.17%、49.42%±2.45%、50. 89%±2.53%，與對照組及空白組比較，觀察組G0/G1期細胞比例升高(P均<0.05)；觀察組、對照組及空白組S期細胞比例分別為26.64±1.08%、39.52%±1.03%、44.69%±2.23%，與對照組及空白組比較，觀察組S期細胞比例降低(P均<0.05)；觀察組、對照組及空白組G2期細胞比例分別為12.78%±1.40%、5.89%±0.68%、9.59%±1.01%，與對照組及空白組比較，觀察組G2期細胞比例升高(P均<0.05)。

2.3 各組細胞上清液胰島素水平比較 5 mM Glucose的KRBH溶液刺激各組細胞后， 觀察組、對照組及空白組細胞上清液胰島素水平分別為(212.56±19.89)、(362.01±21.22)、(367.12±23.78)pg/mg，與對照組及空白組比較，觀察組細胞上清液胰島素水平降低(P均<0.05)；20 mM Glucose的KRBH溶液刺激各組細胞后， 觀察組、對照組及空白組細胞上清液胰島素水平分別為(546.27±31.35)、(790.45±35.86)、(788.37±45.56)pg/mg，與對照組及空白組比較，觀察組細胞上清液胰島素水平降低(P均<0.05)。

2.4 各組細胞CDK8、PDX1、INS、MAFA、GLUT2 mRNA相對表達量比較 見表2。

表2 各組細胞CDK8、PDX1、INS、MAFA、GLUT2 mRNA相對表達量比較

2.5 各組細胞CDK8、Cyclin D1、PCNA、PPARγ蛋白相對表達量比較 見表3、圖1。

3 討論

糖尿病已被認為是最普遍和最嚴重的代謝疾病[3]。由于體內產生胰島素的細胞僅來源于胰腺及胰島移植，因此尋找誘導胰島素產生的細胞和方法對于糖尿病的治療十分重要。細胞和組織經過特定處理后可以誘導胰島素的產生[2]。從胰島產生到胰島素分泌的過程對于維持機體內葡萄糖穩態起到了至關重要的作用，CDK參與調節體內胰島β細胞增殖和胰島素分泌[8]。

表3 各組細胞CDK8、Cyclin D1、PCNA、PPAR-γ 蛋白相對表達量比較

圖1 各組細胞Cyclin D1、PCNA及PPARγ表達情況

CDK8作為細胞周期蛋白依賴性激酶家族中的關鍵成員，可通過大亞基的C末端結構域與RNA聚合酶Ⅱ直接相互作用，以調節基因轉錄。CDK8作用較廣泛，可調控細胞轉錄、增殖、分化以及啟動 DNA 合成等，并在血清和缺氧反應網絡以及多種信號通路等中均發揮作用[10,11]。CDK8表達的改變與一些惡性腫瘤的發生發展具有直接關系，其在異常表達時導致正常細胞周期調控點失常，引發癌癥的發生與發展[12]。本研究以CDK8做為靶基因，采用 RNA 干擾技術沉默胰島β細胞的CDK8基因表達，觀察其對細胞增殖、細胞周期以及胰島素分泌的影響，并分析其相關機制。本研究研究結果表明，干擾CDK8能夠抑制MIN6細胞的增殖活性，并使細胞阻滯于G0/G1期。為了探索干擾CDK8對MIN6細胞胰島素分泌的影響，我們研究了在5 mM或20 mM Glucose 刺激下胰島素的分泌水平，研究結果顯示出在20 mM Glucose 高糖刺激下細胞分泌胰島素的量較5 mM Glucose刺激下明顯增加，但在兩種濃度下干擾CDK8 時胰島素分泌量均下降，這表明干擾CDK8 表達后能明顯抑制MIN6細胞分泌胰島素的功能。

本研究結果顯示，在MIN6細胞中干擾CDK8時，INS2的mRNA被下調，PDX1、MAFA以及GLUT2的mRNA相對表達量均下降。PDX1和MAFA是胰島素轉錄促進因子，GLUT2與葡萄糖運轉相關[13]。PDX1在胰島β細胞分化、胰島β細胞功能維持、胰島發育以及胰島素基因的轉錄過程中發揮至關重要的作用，PDXl的下調會引起胰島素分泌減少、β細胞功能衰退，進一步加重糖脂代謝紊亂，此外，體外研究表明PDXl可以激活各種β細胞特異性基因的表達，例如GLUT2和GCK[14]。MAFA僅在胰島β細胞中表達，并充當胰島素基因轉錄的有效激活劑，MAFA表達發生變化時會影響血糖含量的變化，從而影響胰島素基因的轉錄過程[15]。GLUT2作為重要的葡萄糖傳感器，是肝臟、胰腺、腎臟、腸和腦中的促進性葡萄糖轉運蛋白，胰島β細胞中的GLUT2可使葡萄糖迅速吸收到細胞中，在Glucose刺激胰島β細胞分泌過程中，Glucose通過GLUT2轉運進入細胞，從而與葡糖激酶一起參與磷酸化過程[16]。本研究結果表明干擾CDK8會導致胰島素基因轉錄因子和GSIS通路相關基因表達水平的下調。

Cyclin是調控細胞周期進程主要因子之一，其中Cyclin D1在細胞周期G1～S期進展中起著重要的作用，可使細胞停留于G1期[17]，而PCNA是細胞增殖的關鍵因子之一[18]。PPARγ具有調節葡萄糖代謝、抑制炎癥反應的作用[19]，已有研究表明，激活PPARγ后，通過與特定PPARγ反應元件序列相結合來調控靶基因的轉錄活性，增加組織對葡萄糖的利用，從而通過改善胰島素介導的葡萄糖分解能力來降低血糖[20]。本研究結果顯示，在MIN6細胞中干擾CDK8的表達可下調Cyclin D1、PCNA和PPAR-γ蛋白表達水平，這提示CDK8可能與Cyclin D1、PCNA以及PPAR-γ協同作用，參與了GSIS過程。

綜上所述，在MIN6細胞小鼠胰島β細胞內干擾CDK8 會抑制細胞的增殖活性，使細胞發生G0/G1期阻滯，影響葡萄糖刺激下細胞分泌胰島素的水平，抑制與胰島素轉運相關因子GLUT2 及胰島素合成相關轉錄因子PDX1、INS2和MAFA，機制可能與Cyclin D1、PCNA及PPARγ表達下降有關。因此，下調CDK8可能是糖尿病的發病機理之一。