腹腔注射并飲服海藻糖的糖尿病小鼠腎功能、腎組織結構及凋亡自噬相關蛋白表達觀察

游秀芳，劉宇寧，周治文，查文良，鄭萍

1咸寧市中心醫院(湖北科技學院附屬第一醫院),湖北咸寧437100；2湖北科技學院臨床醫學院

Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病(DM)可導致微血管病變，進一步導致腎小球硬化，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見、最嚴重的并發癥之一，也是造成我國終末期腎病(ESRD)的常見原因[1]。與非糖尿病ESRD患者相比，糖尿病ESRD患者的病死率相對較高[2]?？捎行Х乐蜠N病情進展的藥物研發是目前的研究熱點。海藻糖(Trehalose，TLS)由兩個D-葡萄糖分子的1，1鍵連接[3]，是一種天然存在的非還原性二糖，廣泛存在于多種有機體中，如細菌、酵母、真菌、昆蟲、無脊椎動物以及植物中，雖然哺乳動物中不存在TLS，但TLS酶在人類腸道及腎臟組織中存在表達。TLS能穩定細胞結構，防止蛋白質變性，冷凍儲存時加入TLS可穩定肉的組織結構，有助于保留營養和維生素[4]。海藻糖可作為自噬誘導劑，對各種疾病如帕金森疾病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥以及胰島素抵抗所致的心肌損傷產生保護作用[5]。然而，TLS對DN腎組織的相關作用未見報道。2018年3月～2019年5月，本研究采用鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)建立DM小鼠模型，觀察TLS腹腔注射并飲服對DM小鼠腎臟組織的保護作用，并探討其可能作用機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑及儀器 SPF級雄性C57BL/6J小鼠 60只，購于湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK(鄂)2015-0018，體重20～25 g，12 h晝夜節律燈照，相對濕度45%～60%，室溫20 ℃～25 ℃，通風，適應性喂養1周。TLS(購自武漢漢宇飛揚科技有限公司)，STZ(美國Sigma公司)，尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)、尿酸(uric acid，UA)試劑盒購自武漢生之源生物科技股份有限公司，血糖試紙與血糖儀(長沙三諾生物傳感技術股份有限公司)。凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3以及自噬相關蛋白Beclin-1、p62、LC3B抗體購自美國Cell signaling公司。其余均為進口或者國產分析純化學試劑。3-18K高速冷凍離心機(美國Sigma公司)，JB-P5包埋機(武漢俊杰電子有限公司)，LEICA RM2235病理切片機(德國Leica公司)，KD組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)，HT7700透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司)。

1.2 分組、DM模型制備及TLS干預方法 小鼠60只隨機分為正常對照組、糖尿病模型組(DM組)、TLS正常對照組(TLS組)、TLS糖尿病模型治療組(DM+TLS組)各15只，DM組、DM+TLS組小鼠腹腔注射STZ(PH4.4檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解配制成0.5%的STZ溶液，現配現用，避光于冰上操作，15 min內使用完畢)，50 mg/(kg·d)，連續5 d,制作DM模型。正常對照組小鼠連續5 d注射等容量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。給藥后3、7 d測定各組隨機血糖，造模成功標準：連續2次隨機血糖≥16.7 mmol/L。造模成功后，DM+TLS組、TLS組腹腔注射TLS，1 mg/(kg·d)，連續注射2 d,隨后2%濃度的TLS飲水給藥，自由飲水，連續干預24周。DM組與正常對照組小鼠均腹腔注射等量超純水，連續2 d,后飼養期間正常飲水。

1.3 各組小鼠隨機血糖及眼球血清BUN、Cre、UA檢測 干預24周時取各組小鼠，血糖儀檢測隨機血糖，稱量體重后麻醉，摘除眼球取血，超速離心(3 000 r/min，10 min，4 ℃)后取血，上清液全自動生化分析儀檢測血清BUN、Cre、UA。

1.4 各組小鼠腎臟臟器系數測算及腎臟組織結構觀察 處死各組小鼠，取其雙側腎臟，生理鹽水洗凈后稱重，根據公式：腎臟臟器系數=(腎臟絕對重量/體重)×100%，測算小鼠腎臟臟器系數。將腎臟組織置于4%甲醛溶液中，石蠟包埋切片后光鏡下觀察腎臟組織結構。

1.5 各組小鼠腎臟組織凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3以及自噬相關蛋白Beclin-1、p62、LC3B檢測 采用Western blotting法。取各組100 mg腎臟組織，冰上裂解勻漿，BCA法測定蛋白濃度。根據不同抗體的效價，加入用TBST適當稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。加入HRP標記的羊抗鼠或羊抗兔的IgG抗體，室溫孵育1 h后加入ECL熒光液，顯影。Image-J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，目的蛋白與內參GAPDH條帶灰度值之比作為目的蛋白的相對表達量。重復3次取平均值。

2 結果

2.1 各組小鼠隨機血糖及眼球血清BUN、Cre、UA水平比較 結果見表1。

表1 各組小鼠隨機血糖及眼球血清BUN、Cre、 UA水平比較

2.2 各組小鼠體重、腎臟重量及腎臟臟器系數比較及腎組織形態學結構變化 各組小鼠腎臟臟器系數比較見表2。HE染色光鏡下可見正常對照組小鼠腎小球結構完好；DM組小鼠可見部分腎小管細胞呈氣球樣變，基底膜明顯增厚，毛細血管擴張；DM+TLS組腎小球系膜增厚不明顯，腎小管細胞無明顯氣球樣變。

表2 各組小鼠體重、腎臟重量及腎臟臟器系數比較

2.4 各組小鼠腎臟組織Bax、Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3、Beclin-1、p62、LC3B相對表達量比較 各組小鼠腎臟組織Bax、Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3相對表達量比較見表3，各組小鼠腎臟組織Beclin-1、p62、LC3B相對表達量比較見表4。

表3 各組小鼠腎臟組織Bax、Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3 相對表達量比較

表4 各組小鼠腎臟組織Beclin-1、p62、LC3B 相對表達量比較

3 討論

DN是糖尿病慢性微血管并發癥之一。調查研究中國住院的糖尿病患者中，DN患病率約33%，其中早期腎病占18.0%，臨床腎病占13.2%，腎功能不全占5.3%，尿毒癥占1. 2%[7,8]。DN已成為我國終末期腎功能衰竭的主要原因之一，糖尿病引起的腎損傷是導致終末期腎功能不全的主要原因，并且形勢越發普遍[9]。

糖尿病動物模型的建立可分為兩種：一是自發性糖尿病模型；二是誘發性糖尿病模型，如通過腹腔注射STZ、四氧嘧啶引起胰島β細胞損傷，造成血糖升高。一次性大劑量注射STZ實驗動物死亡率高，連續小劑量注射STZ破壞實驗動物胰島細胞更穩定。本實驗連續5 d給C57BL/6J小鼠腹腔注射STZ，小鼠造模一周后開始出現血糖升高、多尿、多飲食、多飲水、體重減輕等癥狀。

DN的病理基本特征有系膜基質合成增多，腎小球基底膜厚度增加，因此會引起腎小球硬化和腎小球間質出現纖維化病變[10]。本實驗中DM組小鼠明顯可見腎小管細胞呈空泡樣變性，基底膜出現明顯增厚現象；TLS給藥后可顯著減輕糖尿病小鼠的腎臟結構損傷癥狀，維持腎組織基本結構完整。DN引起的腎臟纖維化，最終可致腎小管間質損傷和腎小球濾過率逐漸呈現下降趨勢[11]。本實驗發現DM組小鼠小鼠眼球血BUN、Cre以及UA含量明顯增加，腎功能水平降低，說明TLS在一定程度上改善糖尿病所致的腎功能減退。以上結果表明實驗性糖尿病小鼠出現腎臟損傷，而TLS能夠改善DN小鼠腎功能代謝異常，對腎臟具有一定的保護作用。

DN的發病機制極其復雜，現有研究認為糖脂代謝異常、氧化應激水平增加、腎小管上皮細胞或者足細胞的凋亡在DN的發生發展中起重要的作用[12]。因此，在DN的治療中，靶向抑制細胞凋亡的藥物備受關注。細胞凋亡主要由凋亡誘導基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2共同調控，Bax/Bcl-2比例失衡可激活下游Caspase 信號通路從而誘導凋亡的發生，最終引發功能障礙。為了更好地闡明 TLS抑制DN小鼠腎組織中細胞的凋亡作用，我們進一步檢測了腎臟組織中細胞凋亡信號通路中具有重要作用的抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax和凋亡關鍵蛋白Caspase家族蛋白水平。研究發現TLS可有效抑制DN小鼠腎組織Bax、Caspase-1、Caspase-3水平同時升高Bcl-2的表達，TLS可能通過抑制細胞凋亡從而對DN小鼠發揮保護作用。

自噬廣泛存在于真核細胞內，受嚴格調節的溶酶體依賴性降解途徑，主要負責長壽命蛋白和細胞器的批量降解，與細胞存活、分化和內環境穩態的維持密切相關。近年研究發現，自噬的調控異常參與了DN的病理生理進程[13]，調控自噬有望成為DN防治的新靶標。Beclin-1 是哺乳動物參與自噬的特異性基因，也是Ⅲ類PI3K蛋白激酶的核心復合物，通過募集多個自噬相關蛋白啟動自噬[14]。胞漿型 LC3Ⅰ 向脂質化LC3Ⅱ的轉化標志著自噬體的形成，故LC3Ⅱ公認為是細胞內自噬活性的早期標志蛋白[15]。P62(SQSTM1)能和 LC3Ⅱ相互作用，隨后與其結合的泛素化蛋白或細胞器被包裹入自噬體后降解，其水平與細胞內自噬活性成反比，常用于檢測自噬流。已有研究[16]表明TLS是mTOR非依賴型自噬誘導劑，TLS通過增加細胞自噬小體數量和自噬標記蛋白表達一定程度逆轉神經退行性病癥，延緩發病，延長壽命；此外，海藻糖逆轉基因敲除所致的胰島素抵抗小鼠自噬標記蛋白Atg5，LC3-II表達水平降低從而改善心肌收縮功能障礙[6]。本研究發現糖尿病小鼠腎臟組織中P62水平升高而Beclin-1、LC3Ⅱ水平降低，提示糖尿病狀態下腎臟自噬水平降低；給予TLS治療后糖尿病小鼠腎臟的自噬水平升高，結合本實驗結果表明TLS可能通過激活自噬從而抑制DM的發生發展。

綜上所述，TLS腹腔注射并飲服對DM小鼠腎臟產生保護作用，其機制可能為TLS降低Bax、Caspase-1、Caspase-3及P62表達，促進Bcl-2、Beclin-1及LC3B表達。通過激活腎臟自噬、抑制凋亡發生從而對糖尿病小鼠腎臟產生保護作用，本研究將為臨床防治DN提供新的解決思路，也為尋求開發有效抗DN的新藥物和靶點奠定一定的實驗基礎。