中草藥復配液在臍橙保鮮中的應用研究

盧 山 ，楊 坤 ，黃 超，占 晨，黃長干,*

（1.江西農業大學，功能材料與農業應用化學研究所，江西 南昌 330045；2.江西農業大學校友辦，江西 南昌 330045）

臍橙屬蕓香科柑橘屬植物，果實色澤鮮艷光滑、品質優良，是世界各國競相栽培的柑橘良種，因富含大量對人體有益的必需元素及功效成分深受人們喜愛[1]。在我國的江西、湖北、重慶等省市都有廣泛種植。而江西的贛南地區已經成為國內臍橙的主要產地，每年都有大量的臍橙銷往各地[2]。臍橙易在采摘、貯藏到加工銷售等環節中受機械損傷，加劇了呼吸作用和代謝反應，引發一系列生理生化變化[3]，從而造成病原微生物侵染產生病害，其中又以意大利青霉和指狀青霉引起的青霉病和綠霉病為最主要的病害[4]。因此，如何對采后臍橙進行抑菌保鮮，減少損失成為亟需解決的重大問題。目前，果農主要使用化學合成殺菌劑如抑霉唑、噻菌靈及苯并咪唑來控制青霉病與綠霉病[5]，但長期使用化學合成殺菌劑，易危害人體健康，也易污染環境和提高病原菌的耐藥性[6]。因此，研發廣譜、高效、低毒的天然防腐保鮮劑，便成為當今的研究熱點之一[7]。

中草藥提取物的成分復雜多樣，可生物降解、無污染，而且中草藥資源豐富、安全無毒、價格低廉，有較好的抑菌殺菌作用，因此愈發受到國內外科研人員的重視和青睞，為研發植物源保鮮劑奠定了良好的物質基礎[8]，同時催生了許多對中草藥提取物的研究，如丁香精油能顯著抑制意大利青霉和指狀青霉的菌絲生長和孢子萌發[9-10]，石榴皮提取物對意大利青霉菌的抑制效果與化學殺菌劑抑霉唑無顯著性差異[11]，埃塞俄比亞植物Withania somnifera和Acaciaseyal的甲醇提取物對“巴倫西亞”柑橘的防腐保鮮效果與化學合成殺菌劑噻苯達唑無顯著性差異[12]。課題組以指狀青霉和意大利青霉為靶標菌種，根據前期篩選結果得知：肉桂、丁香、細辛、丹皮、五倍子五種中藥的提取液對指狀青霉和意大利青霉的抑制作用最為顯著[13]，并且肉桂提取液具有最強的抑菌活性[14]。因此，本試驗對這五種提取液中的三種提取液進行1∶1∶1 的比例復配研究，選出最佳復配液，考察其穩定性及其在采后臍橙中的保鮮效果，為復配液的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

供試菌種：指狀青霉（Penicillium digitatum，菌種編號為ACCC30389）、意大利青霉（Penicilliumitalicum，菌種編號為ACCC 30399），均購于中國農業微生物菌種保藏中心。

肉桂、丁香、細辛、丹皮、五倍子，均購于樟樹市華豐藥業有限公司；臍橙摘自江西安遠金贛豐果園。

試劑：丙酮、鹽酸、氫氧化鈉、蒽酮、2,6-二氯酚靛酚、TW-80、滅菌水。

1.1.2 儀器與設備

AUY220 型電子天平，UV755B 型紫外分光光度計，日本YAMATO 高溫滅菌鍋，TS-111C 型恒溫培養搖床，TG20 型高速冷凍離心機，HH-1 型恒溫水浴鍋，Forma-86C ULT Freezer 超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備

取菌種接種于試管斜面培養基，在30 ℃的環境下培養2～3 d 后，用無菌水將培養基中的菌種沖入裝有250 mL 無菌水的錐形瓶中，搖勻，制成孢子菌懸液，使菌液濃度達106/mL。

1.2.2 供試藥材提取液的制備

對于上述五種中草藥，在60 ℃下烘干，粉碎，過40 目篩，加入4 倍體積的丙酮，置于避光陰涼處，每隔24 h 振蕩提取一次，共3 次，搖床搖速為140 r/min，合并濾液后，減壓濃縮，用丙酮定容至濃度為1 g/mL。

1.2.3 最佳復配液的篩選

1.2.3.1 復配提取物的抑菌活性測定

對肉桂、丁香、細辛、丹皮、五倍子的提取液任取三種以1∶1∶1 的比例進行復配，各植物提取液濃度均為1 g/mL，一共10 組復配組合，即CM-1（肉桂、丁香、細辛）、CM-2（肉桂、丁香、丹皮）、CM-3（肉桂、丁香、五倍子）、CM-4（肉桂、細辛、丹皮）、CM-5（肉桂、細辛、五倍子）、CM-6（肉桂、丹皮、五倍子）、CM-7（丁香、細辛、丹皮）、CM-8（丁香、細辛、五倍子）、CM-9（丁香、丹皮、五倍子）、CM-10（細辛、丹皮、五倍子）。采用瓊脂擴散法測定復配液對供試病原菌的抑制作用，把制好的菌液，吸取5 mL 混入冷卻至60 ℃左右查氏培養基，制備帶毒培養基。對稱放置無菌牛津杯，分別于牛津杯中加入200 μL 生藥濃度為1 000 mg/mL的植物提取液，用丙酮作為溶劑對照，置于28 ℃恒溫箱中培養24～72 h，用十字交叉法測量抑菌圈的大小[15]。以不加入復配液的帶毒培養基為對照組，觀察抑菌效果，如果復配液能殺死或抑制培養皿中試驗菌的生長，則在牛津杯周圍會出現一個無菌生長的透明帶即抑菌圈，抑菌圈直徑越大，說明浸提液對此種試驗菌的抑制效果越好。通過各組復配組合的抑菌效果對比，最終選出最佳復配組合。

1.2.3.2 復配液穩定性的測定

以指狀青霉和意大利青霉分別作為供試菌。

（1）將肉桂提取液與最佳復配液分別在日光下放置 0、2、4、8、16、24、48、72 h，進行抑菌試驗。

（2）將肉桂提取液與最佳復配液分別在-18、5、30、60、80、100 ℃下處理 1 h 和經高溫濕熱滅菌（121 ℃）處理30 min 后以進行抑菌試驗。

（3）將肉桂提取液與最佳復配液的pH 值用HCl溶液或 NaOH 溶液調成 2、4、5、6、8、10 六個梯度，放置24 h 后進行抑菌試驗。

（4）將在常溫25 ℃下保存的肉桂提取液以及最佳復配液，每5 d 進行一次抑菌試驗，記錄其抑菌活性的變化。

1.2.4 供試復配液的制備

將效果最好的復配液用0.2%的TW-80 乳化劑稀釋成100 mg/mL 的溶液，該濃度為課題組前期根據采用二倍稀釋法[16]測出的最小抑菌濃度。

1.2.5 最佳復配液在臍橙保鮮中的應用

臍橙的保鮮處理需要選擇大小一致、無病蟲害、成熟度一致和無表面損傷的臍橙。用100 mg/mL 供試復配液浸泡30 s，對照組用清水浸泡30 s，自然晾干。用聚乙烯塑料薄膜袋（32 cm×45 cm，厚度 80 μm）扎口裝袋并分別裝入2 個塑料水果筐內，先在10～11 ℃環境下貯藏3 d，再搬進冷庫（溫度為6～7 ℃，相對濕度為85%）進行低溫貯藏。定期測定各項生理生化指標。

1.2.6 測定指標與方法

1.2.6.1 總糖含量

采用蒽酮比色法進行測定[17]。

1.2.6.2 可滴定酸含量

采用酸堿滴定法測定[18]。

1.2.6.3 VC 含量

采用2,6-二氯酚靛酚法測定[17]。

1.2.6.4 失重率

1.2.6.5 腐爛率

1.2.7 數據處理

所有試驗數據均為3 次重復的平均值和標準差，采用軟件SPSS Statistic 25 進行方差分析，采用軟件Excel 2010 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 最佳復配液的篩選

根據課題組前期篩選已發表的肉桂提取液抑菌效果得知：肉桂提取液對指狀青霉和意大利青霉的抑菌圈直徑為39 mm 和38 mm[13]。從表1 中可看出，10組復配提取液與肉桂單提取液對指狀青霉顯現出不同程度的抑制效果，其中以CM-7（丁香、細辛、丹皮）復配提取液抑制作用最佳，復配液CM-7 對指狀青霉和意大利青霉的抑菌圈直徑分別為40.97 mm 和39.03 mm。CM-7 組與其他9 組復配液的抑菌效果相比，差異均顯著（P＜0.05）。將復配液CM-7（丁香、細辛、丹皮）組對指狀青霉及意大利青霉的抑菌效果與肉桂提取液對指狀青霉及意大利青霉的抑菌效果相比，CM-7 組效果更好且差異顯著（P＜0.05）。因此，從10 組復配液中篩選出最佳抑菌效果的復配液CM-7組比前期已發表的肉桂提取液抑菌效果更好，為最佳抑菌復配液。

表1 復配提取液的抑菌效果Table 1 Fungistasis effect of compound extract 單位：mm

2.2 復配液穩定性研究

2.2.1 光照對CM-7 穩定性的影響

由圖1 可知，隨著光照時間的延長，各組中藥提取液的抑菌效果逐漸下降。但在16 h 前，CM-7 復配液和肉桂提取液的抑菌效果下降趨勢基本一致。16 h以后，肉桂提取液的抑菌效果急劇下降，24 h 之后下降速率趨于平穩，從對指狀青霉、意大利青霉抑菌圈直徑最大的39 mm 和38 mm 分別降為20 mm和23 mm；而CM-7 復配液抑菌效果的下降速率一直很平穩且相對較高，從對指狀青霉、意大利青霉抑菌圈直徑最大的41 mm 和39 mm 分別降為31 mm 和32 mm。由此可知，光照時間在20 h 以上時，CM-7 對指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果極顯著高于肉桂提取液（P＜0.01）。

2.2.2 溫度對CM-7 穩定性的影響

由圖2 可知，CM-7 與肉桂提取液在30 ℃以下的抑菌效果是逐漸上升的，30 ℃時達到頂峰，但是肉桂提取液的穩定性在30～60 ℃之間急劇下降，60 ℃之后下降速率趨于平穩，而CM-7 在30 ℃之后的抑菌效果下降一直都很平穩而且相對較高。溫度達30 ℃以上時，CM-7 對指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果顯著高于肉桂提取液（P＜0.05）。

2.2.3 pH 對CM-7 穩定性的影響

由圖3 可以得知，CM-7 與肉桂提取液的抑菌效果在pH 2～pH 5 是逐漸上升的，且都在pH 為5 時抑菌效果到達頂峰，隨著pH 的升高，CM-7 與肉桂提取液的抑菌效果以大致相同的速率下降。不論pH 如何變化，CM-7 對指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果與肉桂提取液對指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果相比，差異性未達顯著水平。由此可知，不同pH 對復配液與單提取液穩定性的影響基本一致。

2.2.4 貯藏時間對CM-7 穩定性的影響

由圖4 可知，在貯藏20 d 之前，肉桂提取液與CM-7 的抑菌效果大致穩定且保持在較高的水平。但在20 d 之后，隨著貯藏時間的延長，肉桂提取液對意大利青霉、指狀青霉的抑菌圈直徑最大的39 mm 和38 mm 分別降至24 mm 和20 mm；而CM-7 的抑菌效果略有下降，分別從對意大利青霉、指狀青霉抑菌圈直徑最大的41 mm 和39 mm 降至36 mm 和33 mm。在貯藏時間達25 d 以上時，CM-7 對指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果顯著高于肉桂提取液（P＜0.05）。由此可知，貯藏時間的長短對單提取液穩定性的影響高于對CM-7 穩定性的影響。

2.3 CM-7 在臍橙保鮮中的應用

2.3.1 CM-7 對臍橙總糖含量的影響

由圖5 可知，在50 d 之前，對照組與CM-7 處理組的總糖含量隨著貯藏時間延長而升高，且變化趨勢大致一致。但對照組臍橙總糖含量在50 d 時達到最大值，為15.86%，之后大幅度下降至90 d 時的11.59%；而CM-7 處理組則是繼續上升至60 d 時才達到峰值16.26%，之后小幅度下降至90 d 的14.73%。貯藏時間在50 d 以上時，CM-7 處理組臍橙總糖含量顯著高于對照組（P＜0.05），這與陳東杰等[19]研究生物保鮮劑對櫻桃貯藏中總糖的影響相似。

2.3.2 CM-7 對臍橙可滴定酸含量的影響

由圖6 可知，對照組與CM-7 處理組果實中的可滴定酸一直隨時間變化而降低，但在70 d 之后對照組中可滴定酸的下降幅度變大，而復配液處理組的下降幅度基本保持不變，對照組中的可滴定酸含量由0.71%（初值）下降至 0.51%（貯藏 90 d）；CM-7 處理組則由0.71%（初值）下降至0.56%（貯藏90d）。隨貯藏時間的變化，CM-7 處理組臍橙可滴定酸含量與對照組相比差異不顯著。由此可見，CM-7 復配液對臍橙貯藏過程中可滴定酸的影響不大。

2.3.3 CM-7 對臍橙中VC 含量的影響

由圖7 可知，對照組與CM-7 處理組果實的VC含量在10 d 時達到最大值，分別為53.81 mg/100 g 和53.04 mg/100 g，之后兩組VC 含量都逐漸下降。但是在90 d 時，對照組中VC 含量降低至42.97 mg/100 g，而CM-7 處理組VC 含量降低至46.49 mg/100 g。貯藏時間達30 d 以上時，CM-7 處理組臍橙VC 含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.3.4 CM-7 對臍橙失重率的影響

由圖8 可知，前30 d 對照組和CM-7 處理組果實失重率逐漸上升且速率大致相同。但在30～40 d 之間，對照組的失重率急劇上升，40～90 d 之間，對照組失重率變化趨勢趨于平穩，最終90 d 時失重率為5.22%；而CM-7 處理組失重率變化則始終相對平緩，到達90 d 時失重率為2.65%。貯藏時間30 d 后，CM-7 處理組臍橙失重率顯著低于對照組（P＜0.05）。由此可見，CM-7 復配液在臍橙貯藏過程中能減少果實的失重。

2.3.5 CM-7 對臍橙腐爛率的影響

由圖9 可知，在貯藏前20 d，對照組與CM-7 處理組均未出現腐爛個體。對照組在30 d 開始出現腐爛個體，而CM-7 處理組則在60 d 時出現腐爛個體。當貯藏時間到達90 d 時，對照組的腐爛率高達15.56%，而CM-7 處理組則僅有6.67%，二者間差異達極顯著水平（P＜0.01）。由此可見，貯藏時間越長，CM-7 復配液越能大幅度延緩果實的腐爛。

3 結論

篩選試驗表明，在由5 種中草藥提取液中的三種提取液以1∶1∶1 比例配成的 10 種復配液中，CM-7 復配液（丁香、細辛、丹皮）對指狀青霉以及意大利青霉的抑菌效果顯著高于其余9 組，與肉桂單提取液對指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果相比也有顯著差異。而在長時間光照（＞20 h）、高溫（＞30 ℃）或長時間貯藏（＞20 d）條件下，CM-7 復配液的穩定性都顯著強于肉桂單提取液，而pH 的變化對兩者的影響基本一致。

在貯藏中后期（40～90 d），CM-7 復配液可以明顯降低果實的腐爛率和失重率，保證果實的外觀；也能延緩果實總糖、可滴定酸和VC 含量的降低，能夠保持果實良好的營養品質和風味，延長臍橙的貨架期和減少腐爛損失。而總糖、可滴定酸、VC 含量為衡量果實口感的重要因素[20-21]，因此CM-7 復配液能有效維持低溫貯藏期間臍橙的品質。但本次試驗只研究了復配液的穩定性及其對采后臍橙的保鮮效果，未研究復配液發揮抑菌保鮮作用的主要成分；并且試驗提取溶劑為丙酮，雖然以丙酮為溶劑，有著有溶解性好、對細胞穿透力強、成分提取徹底、大多數有效成分均能溶解等優點，但是丙酮也具有毒性，因此選取替代丙酮的低毒溶劑以及復配液中抑菌保鮮的具體成分是什么還有待進一步的研究。