荸薺查爾酮異構酶基因的克隆與表達分析

陳夏鑫, 陳振林, 帥 良, 段振華, 商飛飛, 宋慕波,*

（1.大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.賀州學院食品科學與工程技術研究院，廣西 賀州 542899）

荸薺（Eleocharis dulcis）又名馬蹄，原產于我國南部，為莎草科淺水草本植物。荸薺球莖膨大，是其主要的食用部位，因其口感爽脆、亦果亦蔬的特點自古有“江南人參”的美譽[1]。荸薺球莖生長于淺水污泥之中，削皮困難，因此方便衛生的鮮切荸薺產品深受消費者歡迎。荸薺外皮較厚，帶皮貯藏相對容易，但經切削處理的荸薺極易發生黃化。以往的研究表明，鮮切荸薺的黃化與黃酮類物質的積累有關。Pan 等[2]在黃化的鮮切荸薺表面組織中分離得到了柚皮素和圣草酚兩種黃酮類物質。本課題組在研究中發現，隨著貯藏時間的延長，鮮切荸薺表面組織中柚皮素和圣草酚的含量快速提高，與荸薺表面黃化程度成正相關[3]。查爾酮異構酶（Chalcone isomerase，CHI）是苯丙烷代謝過程中的關鍵酶之一，在黃酮的生物合成過程中起關鍵作用。植物中查爾酮在CHI 的催化下形成二氫黃酮類化合物，進而推動下游黃酮類物質的合成[4]。與其他苯丙烷代謝途徑關鍵酶編碼基因類似，CHI 的表達水平受到外界環境的調控，如強光、干旱和機械損傷等[5]。研究發現，機械傷信號能夠誘導植物CHI 的表達，從而導致更多新酶合成[6]。同時，研究發現銀杏[7]和水稻[8]等植物的CHI 表達與類黃酮物質的積累關系密切。目前針對CHI 基因的研究多集中在高等植物葉片和花中，其在植物莖中，特別是在莖組織響應機械傷過程中的表達調控研究較少。目前仍未在荸薺中克隆到CHI 基因。本研究利用cDNA 末端快速擴增（RACE）技術克隆荸薺CHI 基因全長，對其序列特征進行生物信息學分析，利用熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）技術研究其在不同組織和鮮切荸薺貯藏過程中的表達特征，以期為鮮切荸薺黃化控制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

新鮮荸薺購于廣西賀州市八步區農產品市場，運回實驗室經清洗，挑選大小均一、無機械損傷和病蟲害的果實，去皮后橫切成厚度為0.5 cm 的圓片，樣品分成兩組，對照組在清水中浸泡10 min，處理組在10 mmol·L-1水楊酸水溶液中浸泡10 min，樣品晾干后置于塑料托盤中用0.02 mm 厚聚乙烯膜包裝，于10 ℃下貯藏。在貯藏 0、2、4、6、8 d 分別取樣，將樣品放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于后續基因克隆和表達分析。

植物RNA 提取試劑盒：華越洋生物科技（北京）有限公司產品；SMARTer RACE 5′/3′Kit RACE 試劑盒、SYBR Green qPCR Master Mix 熒光定量酶、PrimeScriptTM RT reagent Kit 反轉錄去基因組試劑盒：均為日本Takara 公司產品；溴化乙錠：生工生物工程（上海）股份有限公司產品；DNA 凝膠回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司產品；瓊脂糖西班牙 Biowest 公司；Tris、乙醇、EDTA-Na2：均為分析純，國藥集團藥業股份有限公司產品。

1.1.2 儀器與設備

SQ510C 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，5424 R 型高速冷凍離心機，G-1000 型 PCR 儀，DYY-6D 型電泳儀，DYCP-31DN 型水平電泳槽，ZF-368 型凝膠成像系統，K5600 型超微量分光光度計，CFX Connect 型熒光定量PCR 儀。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取

采用植物RNA 提取試劑盒提取荸薺總RNA，具體方法按照說明書進行。得到RNA 后利用K5600 型超微量分光光度計測定其純度和含量，RNA 樣品保存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于反轉錄等后續試驗。

1.2.2 基因克隆

3′RACE-cDNA 和 5′RACE-cDNA 的合成具體操作按照 SMARTer RACE 5′/3′ Kit RACE 試劑盒進行。根據之前從荸薺轉錄組數據中得到的CHI 基因片段設計 3′RACE 和 5′RACE 引物（表 1）。PCR 產物經回收、連接（pRACE vector）、轉化（Stellar 感受態細胞）、重組子篩選及菌液PCR 鑒定后，委托華大基因科技股份有限公司進行測序。

表1 基因克隆和表達分析所用引物Table 1 Primers used for cloning and expression analysis

1.2.3 基因生物信息學分析

采用 NCBI 中的 BLASTN、BLASTP 程序進行核苷酸序列及其推導的氨基酸序列的同源性比較；ORF finder 程序尋找開放閱讀框；采用ProtParam Tool 分析蛋白質理化性質；采用Conserved Domains 分析氨基酸序列的保守區域；采用TargetP 1.1 Server 進行氨基酸序列導肽的分析；采用SignalP 4.0 Server 預測蛋白的信號肽；采用Post Prediction 和SubLocv 1.0 進行蛋白亞細胞定位信號預測；ProtScale 以Hphob./Kyte&Doolittle 算法進行親疏水性預測；使用NetPhos 2.0 Server 預測蛋白質序列的磷酸化位點；使用ExPaSy-SOPMA 軟件分析蛋白質的二級結構；使用ClustaW 1.83 軟件進行多重序列比對；采用Mega 5 軟件進行統進化樹構建；采用SWISS-MODEL 預測蛋白質三級結構。

1.2.4 酶活性測定

CHI 活性的測定參照姜悅等[9]的方法略作調整。取鮮切荸薺組織表層1.0 g，加入5 mL 50 mmol·L-1緩沖液（pH 7.5，內含 50 mmol·L-1抗壞血酸鈉、10 mmol·L-1DTT 和0.1%Triton X-100），冰浴中研磨?；旌衔镛D移至 50 mL 離心管，于 4 ℃下 12 000 r·min-1離心 20 min，所得上清為粗酶液。取0.4 mL 粗酶液，加入4 mL Tris-HCl 緩沖液（50 mmol·L-1、pH 7.5，內含 7.5 mg·mL-1牛血清蛋白和 50 mmol·L-1NaHSO3），1 mg·mL-1查爾酮溶液100 μL 引發反應，45 ℃恒溫水浴中保溫30 min，最后加入 6 mol·L-1鹽酸（2 mL）終止反應。對照反應液中的粗酶液由蒸餾水代替。在381 nm 波長處測定吸光值，以每分鐘OD 變化0.01 為一個CHI活性單位(U)，酶活性單位為U/(g FW)。

1.2.5 基因表達分析

根據獲得的CHI 基因序列利用Primer 5.0 設計定量PCR 特異引物（表1）。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit 去基因組及反轉錄試劑盒合成Q-PCR 的模板cDNA，操作方法見說明書。參考Takara 公司的SYBR Green qPCR Master Mix 說明書進行Real-time PCR 擴增。利用2—△△Ct方法計算表達量。各樣品的表達量均為3 次生物重復的平均值。

1.2.6 數據處理

采用Excel 和SPSS 數據處理軟件進行統計分析，結果用3 次重復的平均值表示。

2 結果與分析

2.1 荸薺CHI 基因的克隆

在鮮切荸薺轉錄組數據的差異表達基因中篩選得到1 條與其他植物CHI 基因序列同源性較高的mRNA 序列片段。NCBI 的 BLASTN 比對結果顯示，該片段與多種植物的CHI 基因mRNA 序列相似度在75%以上，其中與水稻（Oryza sativa，XM_015772801）和黑麥（Secale cereale，KC788194）CHI 基因的 mRNA序列同源性最高。利用該片段設計3′ RACE 和5′RACE 引物，進行PCR 擴增后獲得3′和5′端序列分別約為450 bp 和750 bp（圖1 A）。將片段回收后進行測序分析發現3′端序列長度為366 bp，包含了3′非翻譯區（3′UTR）及 Poly A 結構；5′端序列長度為 747 bp 包含了 5′非翻譯區（5′UTR）。同時，根據拼接后獲得的cDNA 全長序列設計引物，以荸薺基因組為模板，克隆得到了編碼區DNA 序列全長，該序列長度為1 182 bp（圖 1B）。

將所得全長cDNA 序列使用ORF Finder 在線軟件進行分析，發現克隆得到的CHI 基因cDNA 全長為1003bp，含有一個744bp 的最大開放閱讀框（ORF）、131 bp 的 5′UTR 區、130 bp 的 3′UTR 區及 31 bp 的Poly A 結構，終止密碼子為TGA。將該cDNA 全長序列在NCBI 上進行比對，發現該序列與水稻和黑麥的CHI 基因相似度較高，為76%。因此，可證明已經克隆獲得荸薺CHI 基因，將此基因命名為CwCHI，其GenBank Accession Number 為 MG719238。CwCHI編碼區DNA 全長 1 182 bp，與cDNA 比對發現，CwCHI的DNA 中有3 個內含子和4 個外顯子，其分布如圖2 所示。

2.2 CwCHI 生物信息學分析

CwCHI編碼蛋白由247 個氨基酸組成。經預測，其分子量為26.410 kD；理論等電點為4.89；分子式為C1197H1852N302O357S7；總原子數為 3 715 個。CwCHI蛋白中最多的氨基酸是丙氨酸（Ala）占12.1%。蛋白整體親水指數（GRAVY）為0.058，脂溶指數為86.56。

利用 NCBI 的 Blast p 和 Conserved domains 進行預測發現，CwCHI蛋白屬于Chalcone_3 super family超家族。CwCHI蛋白含有4 個酪蛋白激酶Ⅱ識別位點，分別位于 14～17、28～31、136～139、176～179；2 個蛋白激酶 C 識別位點分別位于 78～80、118～120；以及2 個 N-豆蔻?；稽c分別位于 48～53、207～212。TMPred 軟件預測顯示，CwCHI蛋白分別有兩個由內到外（46～63,158～174）和由外到內（37～56,157～173）的跨膜區域。使用在線軟件ProScale 預測發現CwCHI蛋白疏水區域與預測的跨膜區域基本一致（圖 3）。

CwCHI蛋白的二級結構以α-螺旋為主，占38.06%，其他結構中無規則卷曲占33.6%，延伸鏈占19.84%，β-折疊結構占8.5%。采用Swiss-model 以系統自動匹配南極毛草為模板（5yx4.1.A）對CwCHI蛋白進行同源建模（圖4），CwCHI的三級結構中α-螺旋是最明顯的結構組件。

通過與其他物種CHI 型蛋白進行多重比對發現，CHI 氨基酸序列較為保守（圖5），尤其是組成活性位點的氨基酸殘基的保守程度更高，表明CHI 作為植物黃酮生物合成途徑中關鍵酶，在進化的過程中保持了較高的遺傳穩定性。與其他Ⅰ型CHI 蛋白類似，在決定底物偏好性的第201 位氨基酸為Ser。采用MEGA 5 軟件的Neighbor-Joining 法構建系統進化樹，CwCHI與油棕櫚和菠蘿的CHI 蛋白親緣關系較近（圖 6）。

（2）星號標注的氨基酸殘基參與活性位點的組成；三角符號標注的氨基酸殘基參決定底物的偏好性。

2.3 CwCHI 基因在荸薺不同組織中的表達分析

黃酮的合成在荸薺的不同組織中廣泛存在，本研究采用熒光定量PCR 技術分析CwCHI基因在根、葉、荸薺皮和荸薺肉中的表達特征。結果表明，CwCHI基因在4 個組織中均有表達，其中荸薺皮中的表達水平最高，而在荸薺肉的表達最低（P＜0.05）（圖7）。

2.4 鮮切荸薺黃化過程中CHI 活性變化及CwCHI的表達分析

水楊酸處理能夠顯著抑制鮮切荸薺的黃化。鮮切荸薺在貯藏過程中，對照組CHI 活性呈上升趨勢，在貯藏4 d 后酶活性快速提高。10 mmol·L-1水楊酸處理能夠顯著抑制鮮切荸薺CHI 活性的上升（圖8 A）。

通過表達分析發現，貯藏過程中對照組CwCHI的表達水平快速提高，2 d 時CwCHI表達量是0 d 的40.6 倍，之后表達量繼續升高，貯藏6 d 后表達量逐漸下降，在8 d 時CwCHI基因表達水平仍顯著高于0 d（P＜0.05）（圖 8 B）。水楊酸處理組CwCHI的表達量在貯藏過程中各時間點均顯著低于對照組（P＜0.05）（圖8 B）。

3 討論與結論

鮮切荸薺黃化與傳統多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）參與的酶促褐變不同，苯丙烷代謝中間產物柚皮素和圣草酚的積累是導致表面黃化的主要原因[10]。苯丙烷代謝途徑中關鍵酶編碼基因的表達受多種環境因素的調控[5]。以往研究表明，傷信號能夠誘導CHI 的表達，促使新酶合成，從而導致植物組織中黃酮的積累[6,11]。因此，鮮切荸薺貯藏期間CHI 活性變化及其編碼基因表達的調控與黃化現象可能存在密切關系。本研通過克隆荸薺CHI 基因全長，并研究其在鮮切荸薺貯藏過程中的表達模式，為揭示荸薺黃化的機理和尋找抑制黃化的方法奠定基礎。

由于CHI 與觀賞植物花色素的形成關系密切，因此在多種花卉中已經克隆得到了CHI 基因。吳彥慶等[12]在芍藥中克隆得到的CHI 基因，其cDNA 編碼區長度為898 bp。桂花中克隆得到的OfCHI基因編碼區長度為747 bp，可編碼248 個氨基酸[13]。本研究在荸薺轉錄組數據中發現了1 個與其他植物CHI 基因同源性較高的基因片段，通過RACE 技術從荸薺中克隆得到其cDNA 全長序列和全長DNA 序列。該基因mRNA 全長為1 003 bp，有一個長度為744 bp的開放閱讀框，可編碼247 個氨基酸，將其命名為CwCHI。CwCHI編碼區對應 DNA 長度為 1 182 bp，其中有3 個內含子區域，內含子和外顯子的交界序列均符合GT-AG 規則。CHI 基因在植物界存在CHIⅠ和CHIⅡ兩種類型，其中CHIⅠ存在于葡萄、擬南芥和大麥等多種植物中，而CHIⅡ則存在于豆科植物中[14-15]。CHIⅠ只能以柚皮素查爾酮為底物，而CHI Ⅱ則可以同時以異甘草素和柚皮素查耳酮為底物[16]。豆科植物中CHI Ⅱ具有4 個外顯子和3 個內含子的典型結構[17-18]。本研究克隆得到的CwCHI雖然也具有4 個外顯子和3 個內含子，但其蛋白保守域卻與CHIⅠ型相同，決定底物類型的Ser-201 也與其他CHIⅠ型相同，而在CHIⅡ型中該殘基為Thr[19]。

CHI 基因的表達水平與植物黃酮類物質的合成關系密切，其表達有明顯的組織特異性，且在不同物種中的表達模式存在差異。在桂花中，CHI 基因在莖中的表達最高，而在花中的表達最低[13]。在臍橙中，CHI 基因的表達在根中最高，在葉中最低[20]。通過對荸薺不同組織CwCHI的表達分析發現，其在根、葉、荸薺皮和荸薺肉中均有表達，而在荸薺肉中的表達水平最低。

鮮切果蔬受到機械損傷后，受傷組織苯丙烷代謝途徑關鍵基因的表達水平快速提高，這是植物對機械損傷響應的重要表現[21]。本研究發現，在貯藏初期對照組鮮切荸薺CHI 的酶活性與CwCHI表達水平較低，但隨著貯藏時間的延長均呈快速上升趨勢，表現出明顯的相關性。Peng 等[22]研究發現，水楊酸處理能明顯抑制鮮切荸薺的黃化，但其抑制黃化的機理仍不清楚。在本研究中，10 mmol·L-1水楊酸處理顯著抑制了鮮切荸薺貯藏過程中CHI 的酶活性和CwCHI的表達。以上結果表明，鮮切荸薺貯藏過程中CHI 活性和CwCHI表達水平的提高與其表面黃化關系密切，水楊酸處理對CHI 活性和CwCHI表達的抑制可能是其延緩鮮切荸薺黃化的原因。