馬度米星銨對克氏原鰲蝦肝胰腺藥物代謝酶活性及其基因表達的影響

宋昕昊,楊丹,季春雷,王佩蓉,張靜靜,彭麟,高修歌,季輝,江善祥

(南京農業大學動物醫學院,江蘇 南京 210095)

馬度米星銨屬于單價糖苷聚醚離子載體抗生素,其抗球蟲活性強、抗蟲譜廣且球蟲不易產生耐藥性,被廣泛用于防治肉雞球蟲病[1]。大部分馬度米星銨以藥物原型經雞的糞便排出[2],糞便作為水體肥料進入水中,導致馬度米星銨污染水體等生態環境。據報道,人誤食馬度米星銨會導致橫紋肌溶解等中毒癥狀,因而進入水體的馬度米星銨作為外源污染物,可能對水產動物健康和人類食品安全構成潛在威脅[3]。水體中的馬度米星銨進入水生動物體內后進行生物轉化,這一過程中藥物代謝酶起重要作用,可將馬度米星銨等外源性化學物進行代謝分解,降低藥物濃度,從而起到解毒作用。研究藥物代謝酶活性對馬度米星銨的響應,可以篩選出敏感的生物標志物檢測水體中馬度米星銨污染。

藥物代謝酶包括Ⅰ相藥物代謝酶和Ⅱ相藥物代謝酶。Ⅰ相藥物代謝酶以細胞色素P450(CYP450)最為重要,它是一類亞鐵血紅素蛋白的超家族酶系,廣泛存在于生物體中,參與多種內源化學物和外源化學物在生物體內的代謝[4]。Ⅱ相藥物代謝酶主要為谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、葡萄糖醛酸轉移酶(UGT)、N-乙?；D移酶(NAT)等,主要作用是與Ⅰ相代謝產物結合,使有毒化合物某些官能團失活,或者增加其水溶性,加快代謝產物排除[5-6]。在水產動物藥物代謝酶活性方面,國內外的研究主要集中于污染物對酶活性的影響[7-10]。因此,深入研究水產動物藥物代謝酶變化對揭示外源性污染物的生態毒性具有重要科學意義。

克氏原鰲蝦又稱小龍蝦,是淡水鰲蝦的一種,對外界環境有很強的適應能力。因其攝食性廣、生存力強,常作為一種檢測水環境污染的指示動物[11]。目前,國內外尚未見馬度米星銨對克氏原螯蝦藥物代謝酶影響的相關報道。因此,本試驗研究了不同劑量的馬度米星銨對克氏原鰲蝦肝胰腺中藥物代謝酶的影響,以期探討藥物代謝酶對馬度米星銨的生物響應并探索適合指示馬度米星銨污染水體的生物標志物,為評估馬度米星銨對水體環境產生的風險提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物和試劑

馬度米星銨(純度>91.9%)購于浙江匯能生物股份有限公司;考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒購于南京建成科技有限公司;NAT、GST、UGT、CYP450酶聯免疫分析試劑盒均購于上海江萊生物科技有限公司;Total RNA Kit Ⅰ購于Omega公司;RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBRPremixExTaqⅡ均購于TaKaRa公司。其他常規試劑均為國產分析純。

1.2 試驗主要儀器

微型旋渦混合儀(XW-80A),上海滬西分析儀器廠有限公司;高速臺式冷凍離心機(3K15,Sigma公司);PCR儀(T100型)、熒光定量PCR儀(CFX96型)、全自動酶標儀(iMark),美國Bio-Rad公司;電子分析天平(BS.210S型),北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 試驗動物與飼養

平均體質量為(21±2.05)g的健康雄性克氏原鰲蝦,購于江蘇省淡水研究所,飼養于南京農業大學實驗動物中心。飼養蝦水是經24 h曝氣的自來水,pH值為7.0～7.4,水溫保持在(21±2)℃,水中溶氧6.0 mg·L-1以上。每2 d換1次水,每天飼喂相當于蝦體質量1%的不含抗生素等藥物的餌料(螺絲肉)。蝦在PCV框中預飼養1周,飼養密度為24尾/框,預養結束后,分組試驗。

1.4 試驗分組與給藥

采用藥浴給藥方法,根據克氏原鰲蝦對馬度米星銨的半數致死濃度(LC50)[12],設定低、中、高3個劑量組,分別為LC50的1/100(0.7 mg·L-1)、1/20(3.5 mg·L-1)和1/10(7.0 mg·L-1),另設空白對照組。試驗用192尾雄性克氏原鰲蝦,每組48尾。試驗期間每天定點喂食,每2 d換1次藥浴液,每次采樣前禁食12 h。在給藥后的7、14、21和28 d取樣,每組每個時間點取12尾,迅速取肝胰腺組織用預冷的0.15 mol·L-1KCl溶液清洗血液后,在液氮中快速冷凍后于-80 ℃保存,用于后續測定。

1.5 肝胰腺代謝酶活性的測定

1.5.1 肝微粒體制備本試驗肝微粒體制備采用鈣離子沉淀法[13]。將肝胰腺從-80 ℃冰箱中取出稱質量,以1∶5的比例(質量體積比)加入勻漿液(0.05 mol·L-1Tris-HCl,含0.01 mol·L-1EDTA、0.15 mol·L-1KCl、100 g·L-1蔗糖),冰浴勻漿5 min,然后4 ℃、10 000g離心20 min,吸出上清液,每1 mL液體加入 0.1 mL CaCl2(88 mmol·L-1)混合,冰浴10 min后,4 ℃、15 000g離心40 min,用緩沖液洗滌1次,所得沉淀用懸浮液(0.05 mol·L-1Tris-HCl,含0.01 mol·L-1EDTA、0.15 mol·L-1KCl、200 mL·L-1甘油)混懸,-80 ℃保存。

1.5.2 肝微粒體蛋白含量和CYP450含量測定將肝微粒體懸液取出,采用Bradford法[14]測定蛋白含量,最終將蛋白濃度均稀釋成1 mg·mL-1。采用細胞色素CYP450酶聯免疫分析試劑盒測定蝦CYP450含量。

1.5.3 CYP b5含量測定取0.2 mL微粒體懸液與1.8 mL Tris-HCl(0.05 mol·L-1)混合,加入4～5 mg連二亞硫酸鈉,充分混勻后,用紫外分光光度計測定吸光值(A424和A490)。CYP b5含量(nmol·mg-1)計算公式為:

CYP b5含量=(A424-A490)×樣品稀釋倍數/(0.171×ρpr)。

式中:0.171為吸光系數;ρpr為樣品蛋白質質量濃度(mg·mL-1)。

1.5.4 氨基比林-N-脫甲基酶(APND)活性測定參照文獻[15],取0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH7.4)緩沖液1.7 mL,加入微粒體懸液0.1 mL、氨基比林(24 g·L-1)0.1 mL,25 ℃水浴2 min后,加入10 mmol·L-1NADPH 0.1 mL,25 ℃水浴30 min。再加入150 g·L-1ZnSO40.35 mL,混勻,冰浴5 min,加入飽和 Ba(OH)20.35 mL,混勻,室溫放置5 min后,2 500g離心10 min,自來水下冷卻。每孔吸取100 μL 加入96孔板,再加入100 μL Nash試劑,混勻,每組3個平行,放于酶標儀中測定D420值。

1.5.5 紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)活性測定將底物更換為4 mmol·L-1的紅霉素[16],其余步驟參照APND活性測定。

1.5.6 苯胺-4一羥化酶(AH)活性測定AH活性測定參照文獻[17],取1 mL 1 mmol·L-1NADPH溶液和0.5 mL 苯胺溶液,混勻,25 ℃水浴2 min。加入0.5 mL微粒體懸液,25 ℃水浴30 min,加入預冷的200 g·L-1TCA 1 mL,冰浴5 min,13 500g離心10 min,取1 mL上清液于新的試管,加入1 mL 10 g·L-1酚和 1 mL 碳酸鈉,混勻,室溫靜置30 min,吸取200 μL于96孔板,每組3個重復,放于酶標儀中測定D630值。

1.5.7 GST、UGT和NAT活性測定分別使用NAT、GST和UGT酶聯免疫分析試劑盒測定蝦NAT、GST和UGT活性。

1.6 肝胰腺CYP450、CYP b5和gst基因表達水平測定

1.6.1 肝胰腺總RNA提取和cDNA合成及引物設計將-80 ℃保存的肝胰腺組織解凍后,根據OMEGA試劑盒說明書提取總RNA,用TaKaRa反轉錄試劑盒進一步反轉錄成cDNA。根據GenBank上發表的克氏原鰲蝦的gst、CYPb5和CYP450基因序列,運用Primer Premier 5.0軟件設計引物,引物由南京擎科生物科技有限公司合成。引物序列詳見表1。

表1 用于RT-qPCR的引物序列Table 1 Primers used for RT-qPCR assay

1.6.2 RT-qPCR反應使用TaKaRa(SYBR?PremixExTaqⅡ)試劑盒用于RT-qPCR分析。將cDNA稀釋5倍,熒光定量反應體系25 μL:熒光預混液12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL和滅菌水9.5 μL。反應過程:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s,40個循環;95 ℃ 10 s;65 ℃ 5 s;95 ℃ 5 s。

1.7 數據處理及分析

2 結果與分析

2.1 馬度米星銨對克氏原鰲蝦肝胰腺Ⅰ相藥物代謝酶的影響

2.1.1 對CYP450和CYP b5含量的影響如圖1所示:0.7 mg·L-1馬度米星銨處理21和28 d后,CYP450含量均顯著高于對照組(P<0.05),而7.0 mg·L-1馬度米星銨處理7、14、21和28 d后,CYP450含量均顯著高于對照組(P<0.05)。各組克氏原鰲蝦肝胰腺CYP b5含量各時間點相比對照組均有波動,但差異均不顯著(P>0.05)。

2.1.2 對APND活性的影響如圖2-A所示:3.5 mg·L-1馬度米星銨處理7、21 和28 d 后,APND活性均顯著高于對照組(P<0.05),而7.0 mg·L-1馬度米星銨處理14和21 d后,APND活性均顯著高于對照組(P<0.05),且7 mg·L-1馬度米星銨處理7 和28 d后,APND活性均極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.1.3 對ERND活性的影響如圖2-B所示:0.7 mg·L-1馬度米星銨處理7、14和28 d后,ERND活性均顯著高于對照組(P<0.05),3.5 mg·L-1馬度米星銨處理7、21和28 d后,ERND活性均顯著高于對照組(P<0.05),而7.0 mg·L-1馬度米星銨處理7、14和28 d后,ERND活性均極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.1.4 對AH活性的影響如圖2-C所示:0.7 mg·L-1馬度米星銨處理14、21和28 d后,AH活性均顯著高于對照組(P<0.05),而7.0 mg·L-1馬度米星銨處理7、14、21和28 d后,AH活性均顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2 馬度米星銨對克氏原鰲蝦Ⅱ相藥物代謝酶活性的影響

2.2.1 對GST活性的影響如圖3-A所示:3.5 mg·L-1馬度米星銨處理14、21和28 d后,GST活性均顯著高于對照組(P<0.05),7.0 mg·L-1馬度米星銨處理7、14、21和28 d后,GST活性均顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2.2 對UGT活性的影響如圖3-B所示:0.7 mg·L-1馬度米星銨處理21和28 d后,UGT活性均顯著高于對照組(P<0.05),7.0 mg·L-1馬度米星銨處理7、14、21和28 d后,UGT活性均顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2.3 對NAT活性的影響如圖3-C所示:0.7 mg·L-1馬度米星銨處理21和28 d后,NAT活性均顯著高于對照組(P<0.05),3.5 mg·L-1馬度米星銨處理14、21和28 d后,NAT活性均顯著高于對照組(P<0.05),7.0 mg·L-1馬度米星銨處理7、14、21和28 d后,NAT活性均顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3 馬度米星銨對克氏原鰲蝦肝胰腺藥物代謝酶相關基因mRNA表達量的影響

2.3.1 對CYP450mRNA表達量的影響如圖4-A所示:0.7 mg·L-1馬度米星銨處理14 和28 d后,CYP450mRNA相對表達量均極顯著高于對照組(P<0.01),3.5和7.0 mg·L-1馬度米星銨處理7、14、21和28 d后,CYP450mRNA相對表達量均極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.3.2 對CYPb5mRNA表達量的影響如圖4-B所示:3.5和7.0 mg·L-1馬度米星銨處理7 d后,CYPb5mRNA相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。其他馬度米星銨處理時間段的各組CYPb5mRNA相對表達量相比對照組均無顯著性差異(P>0.05)。

2.3.3 對gstmRNA表達量的影響如圖4-C所示:0.7 mg·L-1馬度米星銨處理7、21和28 d后,gstmRNA相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05),3.5 mg·L-1馬度米星銨處理7、14、21和28 d后,gstmRNA相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05),7 mg·L-1馬度米星銨處理7、14、21和28 d時,gstmRNA相對表達量均極顯著高于對照組(P<0.01)。

3 討論

3.1 馬度米星銨對克氏原鰲蝦肝胰腺Ⅰ相藥物代謝酶的影響

CYP450酶系是生物對外源有機物代謝的第1階段酶系,由于其可被外源污染物誘導或抑制而使其活性(含量)顯著增加或降低,CYP450常被用來作為生物標記物診斷環境污染。CYP450和CYP b5是藥物代謝途徑中最重要的電子傳遞系統,在藥物代謝中發揮非常重要的作用,因此,通常用CYP450和CYP b5含量變化來推斷藥物代謝酶活性是否被誘導或抑制[18]。APND、ERND和AH分別代表CYP2B、CYP3A和CYP2E1活性,是生物體內參與外源性化合物Ⅰ相代謝反應過程中重要的解毒酶。CYP2B主要代謝親脂性藥物和固醇類藥物,使其轉化為易于排泄的代謝產物,從而起到解毒作用[19]。研究顯示水產動物的CYP3A主要參與大部分親脂性有機化合物的代謝,其活性可受到藥物、環境因素等影響[20]。CYP2E1是參與大部分藥物和環境毒物代謝的關鍵酶。目前,有關藥物對CYP450基因表達及其酶活性影響的研究在甲殼類動物中較為匱乏。本實驗室率先在此領域展開相關研究。

本研究結果顯示,馬度米星銨可以誘導肝胰腺的總CYP450酶系含量。其中代表CYP3A的ERND活性變化最明顯,這可能是因為馬度米星銨是親脂性藥物,而CYP3A主要是代謝親脂性藥物的關鍵酶,所以使其更易受到影響。王國永[21]報道的聚醚類離子載體抗生素對肉雞CYP3A37具有誘導現象,與本結果相一致。符貴紅等[22]也發現脂溶性較高的氧氟沙星在草魚腎細胞中對細胞色素P450 3A的誘導作用?；虮磉_水平方面,CYP450基因的表達量明顯上調,并且總體變化趨勢存在劑量效應關系。CYPb5基因的表達量在7 d顯著上調,之后回到對照組表達量水平,結合之前測定的CYP b5含量變化的趨勢,推測馬度米星銨雖然早期可以誘導該基因的轉錄,但在CYP b5轉錄翻譯及翻譯后修飾仍起重要作用,故其含量未發生明顯變化?？傮w而言,馬度米星銨對3種亞型酶的誘導程度不同,說明不同亞型的CYP450酶的底物與外源性化合物親和力不同,或者結合位點不同,故外源化合物對不同亞型CYP450酶的誘導具有一定程度的選擇性,表現為不同亞型酶被誘導時間的先后或誘導程度存在差異。

3.2 馬度米星銨對克氏原鰲蝦肝胰腺Ⅱ相藥物代謝酶的影響

GST、UGT和NAT是生物體內重要的Ⅱ相代謝酶。GST可以促使谷胱甘肽與親電子性的外源化學物結合,促進其排泄,同時可減少外源性化學物與細胞成分的共價結合,從而發揮解毒效果[23]。目前有關GST活性對污染物暴露的指示作用在水產動物中的研究較多。如王重剛等[9]研究苯并(a)芘、芘及其混合物暴露對梭魚肝臟谷胱甘肽硫轉移酶活性呈誘導作用。UGT也是體內重要的Ⅱ相代謝酶之一,內外源性化合物及毒性代謝物清除與解毒的機制是其經UGT催化轉化為極性較強的結合物,后經腎臟排出體外,從而完成內外源性化學物以及毒性代謝物在體內的代謝消除[24-25]。NAT主要作用為催化乙?；鶊F從乙酰CoA轉移到其作用底物芳香胺及雜環胺類物質上,在哺乳動物上主要參與活化或滅活芳香胺類藥物[25-26]。

本研究中,馬度米星銨可使克氏原螯蝦的GST活性顯著升高,推測可能是在馬度米星銨脅迫下,克氏原鰲蝦通過激活體內GST,以應對藥物對機體各重要成分的損害作用。Oliveira等[27]在研究土霉素對斑馬魚的毒性作用時也發現了GST活性被顯著誘導的現象;聶湘平等[28]研究發現環丙沙星顯著誘導異育銀鯽和劍尾魚GST活性。從處理14 d開始,GST活性呈良好的劑量效應關系,初步判斷GST可能作為指示馬度米星銨污染水體的指示物,后續將進一步探究。馬度米星銨各劑量組的UGT活性與對照組相比均有所升高,推測在馬度米星銨脅迫下,加快了UGT對非結核型膽紅素選擇性催化,將其快速轉化為水溶性膽紅素葡萄糖醛酸結合物,加速從干細胞分泌至膽汁中消除,使解毒過程加快。在暴露期間,克氏原鰲蝦肝胰腺中gst基因表達量顯著上調,說明馬度米星銨能迅速誘導gst基因的表達,催化GSH等內源性化學物與Ⅰ相代謝產物結合,從而減少外源性化學物與細胞成分的共價結合,降低外源性化學物對機體產生的危害。隨著暴露時間的延長,并未有抑制現象出現,這也間接解釋了克氏原鰲蝦對馬度米星銨的耐受程度較高。Sabatini等[29]報道MC-LR拌料飼喂溪蟹時,其肝胰腺中GST活性增加70%,GSH含量減少50%?？傮w來看,3種Ⅱ相代謝酶對馬度米星銨的響應中,GST較理想,而UGT和NAT變化規律較差,僅能得出總體呈誘導趨勢,不能作為良好的指示物。

綜上所述,馬度米星銨能顯著誘導克氏原鰲蝦肝胰腺Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝酶,在試驗期間無克氏原鰲蝦死亡,表明誘導藥物代謝酶可以促進機體解毒,增強其耐受性。Ⅰ相代謝酶ERND和Ⅱ相代謝酶GST對馬度米星銨的響應較為敏感,因此初步可將2種酶活性變化作為早期指示物,進行多時段聯合測定,增強馬度米星銨污染暴露指示的敏感性和有效性,為評價馬度米星銨在水體環境中的風險評估提供依據。