AHLs類信號分子對IFFAS工藝影響研究

徐 嘉 蔚， 劉 濤

( 大連理工大學 環境學院, 遼寧 大連 116024 )

0 引 言

生物膜與活性污泥復合工藝在工業和城市污水處理中的應用已有20多年的歷史[1]．該工藝兼具生物膜法和活性污泥法的優勢，如對污染物處理能力強、抗沖擊負荷能力強、傳質效率高[2-3]等，還能克服兩種工藝的弊端[4]．生物載體是該工藝的核心部分，其主要特點在于能夠維持反應器內較高的生物量濃度[5]．同時，相比固定式生物載體，可移動的懸浮生物載體具有更優越的性能，而基于懸浮生物載體的生物膜與活性污泥復合(integrated floating fixed-film activated sludge，IFFAS)工藝受到了廣泛的關注．

但IFFAS工藝普遍存在啟動周期長的問題，這主要是由于傳統載體材料(如聚乙烯(PE)、聚丙烯)的生物親和性差，使得生物膜在載體表面的形成速度慢，從而導致工藝啟動較慢[6]．因此，開發新型載體以促進微生物在載體表面的生長具有重要的現實意義．目前，對載體材料改良的主要方向是改變載體表面的理化性能．如向制備載體的原料中添加具有親水性的功能料以及具有正電荷性的功能料以改善微生物在載體表面的附著效果，或向原料中引入功能基團(羰基等)以加速電子傳遞[7]．本課題組前期對載體親水親電性能的改性做了一系列的研究[7-9]，研究結果表明，改性載體較傳統載體具有更快的掛膜速度，其反應器具有較強的污水處理能力，但載體表面的生物膜不穩定、易脫落的現象仍然存在，因此，提高生物膜的穩定性對污水處理有重要意義．

在以往的實驗過程中發現，生物膜在某一時間段會有生物膜量突增的現象，而最新的研究表明，微生物的聚集行為不僅取決于環境條件，還取決于微生物間的一種被稱為群體感應(quorum sensing，QS)的效應[10]．所謂群體感應，是指微生物向環境中釋放某些物質(信號分子)，其能夠在細胞間進行自由擴散，并隨著細胞密度的增加，信號分子濃度也不斷積累，當達到一定閾值后，信號分子會進入微生物細胞內誘導相關基因的表達，從而起到調控菌群的生態關系以及生理行為的作用[11]．迄今為止，由N-?；呓z氨酸內酯(N-acyl-homoserine-lactones，AHLs)類信號分子介導的QS被證明是參與生物膜形成和生長的重要QS系統之一[12-13]．隨著對QS系統更加深入的研究，通過人為干預QS來調控細菌生理行為的方法受到了關注．有研究表明，向生物膜工藝中添加適當適量的AHLs類信號分子，不僅能夠增加生物膜表面的生物量，還能夠改善系統處理效果[14-15]．此外，硝化細菌、厭氧氨氧化細菌以及反硝化細菌等水處理中重要的脫氮菌都被發現與QS密切相關[16-18]．

基于此，本研究通過向IFFAS系統中投加改性載體以及一定量的AHLs類信號分子，與活性污泥系統、投加傳統載體的IFFAS系統以及添加改性載體的IFFAS系統對比，考察在改性載體和群體感應共同作用下的IFFAS工藝的掛膜效果和水處理效果，以期通過將群體感應作用與改性載體協同，調控功能菌群，提高系統的掛膜速度并強化系統的污水處理能力，為IFFAS工藝的推廣應用提供理論依據．

1 實驗與方法

1.1 改性載體的制備

本研究所使用的改性載體和聚乙烯傳統載體均自主生產．改性載體的改性功能料為聚季銨鹽-10(PQAS-10)(2%，親水性、親電性)、斜發沸石(2%，氨吸附性)和滑石粉(1%，質量控制)．將經機械攪拌混勻的原料投入單螺桿擠出機，經模具擠出成型，該過程中進料階段、熔融階段、混合階段和擠出階段的筒區溫度分別為125、135、145、120 ℃．兩種載體均為中空圓柱體，表面豎向伸展“鰭”，內部有十字支撐，直徑和高均為10 mm，平均比表面積約為600 m2/m3．

1.2 實驗裝置與操作方法

1.3 分析方法

1.4 AHLs類信號分子的檢測

由于體系中AHLs的濃度很低，測試前需要進行濃縮．參照Wang等[26]的研究，利用固相萃取技術(SPE)對樣品進行1 000倍濃縮．SPE所用儀器為全自動固相萃取儀(AT-280)，固相萃取柱為HLB(6 mL，Waters Oasis)，活化劑為甲醇和水，洗脫劑為甲醇．

采用液相色譜-四級桿質譜聯用儀(Agilent RRLC/6410)測量AHLs，根據胡惠秩[27]的研究和實際條件，確定超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)的參數，色譜條件為C18色譜柱(直徑4.6 mm，長度150 mm，填料粒徑5 μm)，色譜分離流動相：A為含有0.1%甲酸的超純水，B為含有0.1%甲酸的乙腈，流速0.25 mL/min梯度分離(乙腈30%開始到60%止)，進樣量為20 μL，保持柱溫40 ℃．質譜條件為ESI(+)電噴霧離子源，多反應離子監測模式(MRM)，脫溶劑氣溫度為300 ℃，離子源溫度為100 ℃，去溶劑氣氮氣流速8 L/min．

1.5 載體表面生物膜形態表征

將載體切割成條狀樣品，再對載體表面成熟期生物膜進行固定、清洗、脫水、干燥、鍍金等預處理，后采用掃描電子顯微鏡(Hitachi S4800，日本)觀察生物膜形貌．

1.6 微生物群落結構分析

采集反應器中污泥和載體表面生物膜樣品，參照說明書(OMEGA試劑盒)提取樣品中的DNA，利用V4V5區引物(前端引物515F-5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′；后端引物907R-5′-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′)對樣品中的16S rRNA基因進行PCR擴增，采用歐易生物的Illumina Miseq測序儀(Illumina 2000)進行高通量測序(high throughput sequencing，HTS)，再通過Trimmomatic、QIIME(split_libraries)等軟件進行微生物群落結構分析．

2 結果與分析

2.1 生物膜生長情況

2.1.1 生物膜量的變化 生物膜在載體表面的形成可以看成是載體表面生物膜量的固定過程．微生物在載體表面的固定一般分為3個過程：微生物在水力作用下向載體表面遷移過程、可逆附著過程和不可逆附著過程[28]．每個過程的生物膜增長速率有一定的差異．本實驗R2、R3、R4生物膜量Q在生物膜形成過程中的變化如圖2所示．在反應器啟動初期(2周)，3個反應器內載體表面的生物膜量略有增長(2周內3組反應器生物膜量不超過1 g/m2)，說明該時期的微生物處于對新環境的適應階段．在第4至10周生物膜量一直處于增長狀態，說明該時期是生物膜快速形成的活躍期．在第10周之后生物膜量基本保持穩定(較第2周增加了300%以上)，說明此時生物膜基本成熟．

在生物膜的形成過程中，3組反應器中載體表面生物膜量呈線性增長趨勢，R2、R3、R4反應器中載體表面的生物膜量平均周增長速率分別為0.34、0.44、0.46 g/(m2·周)．顯然，改性載體表面生物膜量增長速率明顯大于傳統載體．當生物膜量穩定時，R2的生物膜量為3.28 g/m2，相比而言，改性載體表面生物膜量分別為4.33 g/m2(R3)和4.57 g/m2(R4)，說明改性載體能夠顯著提高載體表面生物膜量，這主要歸因于改性載體表面生物親和性的改善．而添加AHLs類信號分子的R4中載體表面的生物膜量較R3略有提高，說明添加信號分子能夠增強微生物在載體上附著生長的能力．

2.1.2 生物膜結構的變化 生物膜中不同種群細菌之間的交聯主要和EPS有關，因此研究EPS在生物膜形成中的變化規律有助于考察生物膜結構[29]．EPS組成較復雜，主要為多糖和蛋白質，其比值(Qps/Qpn)能夠反映生物膜特性．本實驗R2、R3、R4載體表面的EPS在生物膜形成過程中變化如圖3所示．

在掛膜過程中載體表面多糖和蛋白質含量變化規律表現為均在增長一段時間之后趨于平緩．當載體表面的多糖和蛋白質含量達到穩定階段時，R3中載體表面的多糖和蛋白質略高于R2中的，說明改性載體相比傳統載體能夠增強生物膜的附著性和生物活性．而添加AHLs的R4反應器中載體表面的多糖和蛋白質含量明顯高于R2、R3中的，能夠達到0.34 g/m2(多糖)和1.38 g/m2(蛋白質)，分別是R2中載體表面的2.21倍和1.43倍，是R3中載體表面的1.85倍和1.07倍．說明添加適量的AHLs類信號分子能夠促使微生物分泌蛋白質和多糖，且其對多糖的促進作用高于蛋白質．

除此以外，有研究發現在生物膜的形成過程中，多糖和蛋白質對形成生物膜的作用不同，多糖能夠起到黏附更多微生物的作用，而蛋白質則保證了生物膜的抗沖擊能力，因此可以Qps/Qpn作為分析生物膜形成階段的指標[30]．在該實驗中，3組反應器中載體的Qps/Qpn隨著生物膜的形成先達到峰值，并在第8周之后下降到一定水平并保持平緩．R3中載體的Qps/Qpn在前期比R2的高，在第10周與其基本一致，這可能是導致改性載體生物膜較傳統載體生物膜生長快的因素之一．而添加一定量的信號分子后Qps/Qpn發生了明顯的變化，R4中載體上的Qps/Qpn在生物膜形成前期(第4周)達到了較高水平，分別是R2和R3中載體的2.16倍和1.74倍，在穩定之后的Qps/Qpn仍比R2和R3高．這可能是由于外源信號分子對多糖分泌的影響比對蛋白質分泌的影響更顯著，從而影響生物膜結構，該結果與胡慧秩的研究結果一致[27]．

2.1.3 AHLs濃度的變化 實現群體感應的信號分子種類很豐富，本研究選取了4種常見的AHLs類信號分子：C4-HSL、C8-HSL、3OHC12-HSL、C14-HSL．分別在反應器運行第4周和第14周時對4組反應器中的AHLs含量進行定量．各階段各反應器中信號分子濃度如圖4所示．

在系統啟動的第1～2周，微生物尚未適應新環境，活性較低，分泌的信號分子較少，而系統為連續流，使得信號分子難以累積，因此幾乎所有AHLs信號分子濃度均低于檢測線，難以定量．第4周之后，微生物已適應新環境，活性升高，分泌信號分子速率提高，系統中能夠檢測到AHLs并對其定量．第4周時，反應器中不同類型的AHLs含量有差異，未添加信號分子的反應器分泌的各類AHLs差異不大．第14周后未添加信號分子的系統內AHLs濃度較第4周略有上升，說明此時群體感應細菌活躍度較高，能更快地分泌信號分子；而R4中的C4-HSL濃度卻比第4周時低，說明這個時期反應器內添加的C4-HSL多被細菌接收消耗，結合前文得出的添加信號分子能夠改變生物膜結構的結論，被消耗的C4-HSL可能是影響生物膜結構的重要因素．

2.1.4 載體表面的微生物群落特征形貌 R2、R3、R4中載體表面的生物膜生長穩定后(第12周)，通過SEM觀察，結果如圖5所示．低倍鏡下，R2中傳統載體表面附著的生物膜塊較小且稀疏，R3中改性載體表面附著的生物膜塊較大且密集，而R4中改性載體表面附著的生物膜塊不僅大而密集，且有部分重疊層．在高倍鏡下觀察時能夠看出，R2中傳統載體表面的微生物以桿菌和少量菌絲交聯；R3中改性載體表面的微生物聯結明顯更加緊密，且除了桿菌還有較多球菌；而R4中改性載體表面的微生物形成的大團簇更加明顯，細菌之間的聯結更加緊密．以上結果表明，微生物在R4中的載體表面附著效果最好，推測可能為添加的信號分子起了較大的作用．

2.2 污染物去除效果

2.2.1 COD去除效果 由于國內生活污水碳氮比呈不斷降低的趨勢，為使出水總氮達標，通常會在處理過程中投加外加碳源，從而增加了處理費用．因此，本研究采用分階段降低進水碳氮比的方式運行，以節省進水的碳源．第14周起，持續對4組反應器中的化學需氧量進出水濃度進行測定，COD變化情況如圖6所示．

無論是高碳氮比(碳氮比為8，c(COD)=300 mg/L)還是低碳氮比(碳氮比為4，c(COD)=160 mg/L)的情況，溶解氧適中(c(DO)=(1.5±0.3) mg/L)或低(c(DO)=(0.8±0.3) mg/L)的情況，4組反應器的出水COD基本能達到國家一級A標準(50 mg/L)．隨著進水碳氮比的降低，COD去除率略有降低．在低碳氮比時，投加了載體的反應器的COD平均去除率為81.2%～83.6%，高于僅有活性污泥的反應器(R1)的COD平均去除率(76.8%)，說明IFFAS工藝相比于活性污泥工藝更有助于去除污水中的COD，分析原因是由于載體能夠富集較多的異養菌，異養菌活性較大，能夠利用更多的COD．

在第2階段，保持溶解氧不變，降低進水COD濃度以降低碳氮比到6，R4出水氨氮和總氮仍然很穩定，而其他反應器均出現了較大的波動，且R2和R3出水已不能達到國家一級A標準．這說明由于信號分子AHLs的加入，IFFAS系統能夠保持較好的穩定性．與此同時，R2和R3反應器內出現了污泥膨脹的現象，其原因可能是曝氣不穩定導致溶解氧在反應器內分布不均，形成部分區域溶解氧濃度過大，部分區域溶解氧濃度過小的情況，從而導致絲狀菌大量繁殖引起污泥膨脹．因此在這個階段之后降低溶解氧濃度并充分攪拌使反應器內部各個區域均保持在(0.8±0.3) mg/L．運行一段時間之后污泥膨脹現象消失，R3和R4氨氮出水濃度能夠達到國家一級A標準，R4總氮出水濃度也能達到國家一級A標準．R1、R2、R3、R4的氨氮平均去除率分別為83.0%、85.7%、86.6%、94.8%，總氮平均去除率分別為48.0%、54.2%、55.9%、65.3%．顯然，R4的氨氮和總氮去除效果明顯優于其他3組反應器．分析原因，投加的改性載體較傳統載體有更好的親水性和親電性，更有利于富集硝化菌和反硝化菌，且改性載體中的功能料天然沸石能夠吸附氨氮，從而促進硝化菌快速生長[9]；而添加AHLs不僅能夠改變載體表面生物膜結構，使其更有利于微生物的生長，同時，AHLs還能促進硝化和反硝化效果．因此，R4表現出更強的脫氮能力．

在第4階段繼續降低碳氮比為4．此時除R1外的3組反應器的出水氨氮濃度均能滿足國家一級A標準，但出水總氮濃度有所上升．值得注意的是，R4的總氮去除效果較其他反應器好，去除率為58.8%，但較前三階段有所下降．可能由于該條件下碳源較少，不能為反硝化提供足夠的電子受體，從而導致了硝態氮和亞態氮的積累．

2.3 細菌群落分析

2.3.1 多樣性 在研究不同條件下污染物去除效果的實驗第4階段結束后，對R1、R2、R3和R4中的懸浮污泥以及R2、R3和R4中載體表面的生物膜進行16S rRNA高通量測序后分析樣本內細菌群落結構特征．其群落結構多樣性以及豐富度指數如表1所示．本次測序覆蓋率均達到99%以上，說明本次測序結果可靠．從每個樣本中獲得至少31 701個有效序列，7個樣本可分別獲得432～523個操作分類單元．Shannon指數、Simpson指數和Chao1指數均能估算群落分布多樣性．

表1 不同反應器中懸浮污泥和載體表面的微生物豐富度指數

由表1可得，R2、R3和R4中載體表面的微生物群落多樣性均大于其反應器中懸浮污泥的，說明載體不僅能夠富集更多的生物量，還能吸引更多的微生物種類在其上生長．傳統載體和改性載體表面的微生物群落多樣性差別不大，但添加AHLs后載體表面的細菌多樣性卻相對下降，結合其生物活性和污染物降解效果較強的結果，分析出現該現象的原因是受AHLs類群體感應調控作用的影響，載體表面某些功能菌的含量相對增加，而有一些細菌在實驗過程中被淘汰．

2.3.2 細菌群落 從門水平分析，4組反應器中的懸浮污泥樣品和載體表面生物膜樣品中的優勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，添加了AHLs的R4生物膜中的擬桿菌門比例比其他反應器中的高，但硝化螺旋菌門(Nitrospirae)卻較低，分析原因可能是AHLs對擬桿菌門的影響比對硝化螺旋菌門的影響大．

從目水平下進一步分析細菌群落，將系統中的功能菌目分為6種類型，分類結果如表2所示．R3中的聚磷菌總占比明顯高于R2，而R4中反硝化菌和聚磷菌的優勢更加明顯，這能夠解釋前文硝化速率變化與反硝化速率變化有差異的原因．說明改性載體的投加對反硝化菌的富集更有效果，而添加AHLs類信號分子能夠強化反硝化菌的生長能力．且R4中的硝化菌比R3占比低，但污染物降解效果卻仍有提升，說明添加AHLs類信號分子也能提高硝化菌的硝化效率．

表2 目水平功能微生物菌群及比例

從污染物降解的角度看，投加載體能夠為不同細菌提供生長環境，改性載體能夠促進微生物的掛膜生長，而添加AHLs類信號分子能夠極大程度地提高一些反硝化菌的生長與活性．這對于IFFAS工藝利用改性載體和群體感應現象提高處理能力提供了新的思路．

3 結 語

相比于傳統載體，添加改性材料的載體生物親和性較好，載體表面生物膜量增長速率較快，生物膜生長穩定后載體表面生物膜量較高，在AHLs作用下的改性載體具有較高的蛋白質和多糖含量．改性載體和AHLs的共同作用，使得反應器具有更高的COD、氨氮和總氮去除效果，且對低碳氮比水質具有更好的適應性．此外，AHLs能夠明顯提高反硝化菌Zoogloea的相對豐度．