純種強化發酵細菌型水豆豉細菌菌群動態研究

郭 婭，黃曉潤，黎忠杰，曾金興，陶 怡，吳擁軍

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽 550025）

豆豉是以黃豆、黑豆為主要原料，利用微生物發酵制成的調味副食品，是深受我國民眾歡迎的傳統發酵食品[1]。其中，水豆豉是以大豆為原料，煮熟堆積保溫發酵后添加佐料（辣椒、姜）而制成的市售產品。貴州水豆豉作為貴州地區特色微生物發酵大豆食品，其主要為細菌型豆豉。研究發現，豆豉中含有多種生理活性物質，具有特殊的保健作用，能促進皮膚、小腸粘膜損傷修復，保證機體生物氧化正常進行，并含有18種氨基酸，其中7種為人體必需氨基酸[2-4]。此外，還具有和胃、除煩、祛寒的功效，對減少血中膽固醇、降低血壓也有一定作用。

迄今為止，對豆豉安全性方面的研究很少。在已有報道中，黃欣[5]從瀏陽豆豉中分離出危害腎臟的赭曲霉（Aspergillus ochraceus）和可致動物肝癌、胃癌的聚多曲霉（Aspergillus sydowi）；廖萬清等[6]研究發現，聚多曲霉可引起阻塞性支氣管曲霉??；蔣立文等[7]研究發現，曾有因食用細菌型豆豉引起的A型肉毒毒素中毒事件；WEI C L等[8]研究發現，組胺、高濃度NaCl、黃曲霉毒素也對豆豉食用性產生影響，所以豆豉內微生物種類對食用安全存在極大影響，是一個值得關注的焦點。

聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）技術能分離長度相似但序列組成不同的雙鏈聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物[9-10]，是檢測微生物群落遺傳多樣性的主要分子生物學方法之一。MUYZER G等[11]在1993年首次將DGGE技術應用于微生物群落結構[12-13]的研究，1999年首次應用于食品微生物多樣性檢測[14-15]。目前，DGGE技術已廣泛應用于發酵食品中微生物多樣性的研究[16-17]。

本研究采用PCR-DGGE技術首次對貴州枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2純種強化發酵的細菌型水豆豉工廠化生產過程中前發酵（制曲期間）和后發酵過程中細菌菌群變化進行研究，解析細菌型水豆豉生產過程中食源性致病菌的動態變化，對評估其生物安全性以及指導生產控制具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

豆豉樣本：貴陽某水豆豉生產企業。

1.1.2 菌株與載體

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ 3-2、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）：本實驗室保藏菌種；測序載體pGEM-T Easy Vector System I：美國Promega公司。

1.1.3 試劑

尿素、三羥甲基氨基甲烷、甲叉雙丙烯酰胺：美國BIO-RAD公司；過硫酸銨：北京Solarbio公司；乙二胺四乙酸二鈉、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）：美國AMRESCO公司；冰醋酸：重慶川江化學試劑廠；GelRedTM 1000：美國BIOTIUM公司；氯化鈣：德國Sigma公司；瓊脂糖：吉恩（上海）貿易有限公司；甲醛：重慶川東化工（集團）有限公司；無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母粉：上海根生生物科技有限公司；NaCl：蘇州同盛醫藥科技有限公司；瓊脂粉：美國Sigma-Aldrich（集團）有限公司；E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit Ⅰ（200）、E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit（200）：美國Omega公司；Bacterial Genomic脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Extraction Kit Ver.3.0：日本Takara公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.4 培養基

LB固體培養基：胰蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，氯化鈉1 g，瓊脂粉3 g，去離子水100 mL，調pH值至7.2。LB液體培養基中不添加瓊脂粉。

1.2 儀器及設備

DCodeTMUnivesrsal Mutation Detection System、C1000 TouchTMThermal Cycler、Univesrsal Hood Ⅱ凝膠成像分析儀：美國Bio-Rad公司；Eppendorf Centrifuge 5417R離心機：德國Eppendorf公司；Applied Biosystems Veriti 96 Well ThermalCycler聚合酶鏈式反應儀：上海拜力生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 純種強化發酵細菌型水豆豉工藝[18]

將高溫高壓（110 ℃、20 min）蒸煮好的黃豆，冷卻至40～50 ℃，活化枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2菌液使其OD600nm值在0.5～0.8，按4%接種量噴霧接種，攪拌均勻，置于發酵室，37 ℃發酵66 h（前發酵）制曲，按配方添加輔料（生姜、辣椒、食鹽），裝瓶，放入恒溫室，40 ℃發酵7 d（后發酵），即為成品水豆豉。

采用五點定時取樣法取200 g純種強化發酵細菌型水豆豉，混勻，4 ℃密封保存。前發酵為每6 h取樣一次，周期3 d；后發酵為每天取樣一次，周期7 d，共19個樣。

1.3.2 水豆豉宏基因組提取

分別取前發酵和后發酵期間不同時間段的水豆豉樣品5 g，置于10 mL無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.2）中，150 r/min離心30 min，自然沉降5 min，吸取1 mL菌懸液，12 000 r/min離心2 min，棄上清；加1 mL無菌水重懸清洗，12 000 r/min離心2 min，收集菌體。采用Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取水豆豉樣品的宏基因組，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 PCR擴增

以水豆豉宏基因組為模板，選用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）及1492R（5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'）對細菌的16S rDNA進行PCR擴增。PCR擴增體系：10×PCR Buffer 2 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1.6 μL、27F 0.4 μL、1492R 0.4 μL、模板0.4 μL、rTaq酶0.1 μL、超純水15.1 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環；72 ℃再延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

以16S rDNA序列為模板，采用引物338F（帶GC夾）（5'-CGCCCGCCGCGCGCCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGTACGGGAGGCAGCAG-3'）及518R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）對細菌的16S rDNA的V3區序列進行降落式PCR擴增。

PCR擴增體系：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、338F 1 μL、518R 1 μL、模板1 μL、rTaq酶0.25 μL、超純水37.25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，68 ℃（每循環降0.5 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，20個循環；72 ℃再延伸7 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 DGGE電泳及圖譜分析

參照MUYZER G等[11]方法，對16S rDNA的V3區序列PCR擴增產物進行DGGE，凝膠成像拍照，用Quantity One分析電泳條帶差異。

1.3.5 DGGE切膠回收及克隆測序

切取DGGE明亮的目的條帶，加雙蒸水（ddH2O），4 ℃過夜保存。取1 μL上清液作為模板，用不帶GC夾的V3區引物338F'（5'-TACGGGAGGCAGCAG-3'）及518R'（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）進行PCR擴增，采用E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit（200）回收純化，與載體pGEM-T Easy Vector System I連接后，轉化至E.coli（DE3）感受態細胞，涂布于含有60 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養基，37 ℃過夜培養。挑取陽性單菌落加入含有60 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基，37 ℃、180 r/min培養12 h，提取質粒，委托大連寶生物公司測序。

1.3.6 數據分析

采用Quantity One 4.6.2軟件對DGGE圖片處理分析。將優勢條帶和變化明顯的條帶切膠回收后測序，測序所得的16S rDNA的V3區序列提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行Blast同源性比對搜索[19]。采用Sensitivity 10、Lane Width 4mm、Min.Density 0.00%、Noise Filter 4.84、Shoulder Sens.1.0處理電泳條帶、粗定量分析。

2 結果與分析

2.1 水豆豉樣品宏基因組的提取

水豆豉樣品宏基因組的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。由圖1可知，基因組條帶都較為完整、少量降解，基因片段堿基長度在15 000 bp左右，可進行16S rDNA PCR擴增。

圖1 細菌型水豆豉前發酵（A）及后發酵（B）樣品的宏基因組Fig.1 Metagenome of bacterial water-Douchi samples in pre-fermentation (A) and post-fermentation (B)

2.2 PCR擴增

以純種強化發酵細菌型水豆豉前發酵（A）及后發酵（B）樣品的宏基因組為模板進行16SrDNAPCR擴增，結果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產物條帶單一且堿基長度為1 500 bp左右，與目標結果相符，可用其作為模板進行16S rDNA V3區序列PCR擴增，結果見圖3。由圖3可知，PCR擴增產物條帶單一且堿基長度為250 bp左右，與目標結果相符，可用于DGGE實驗。

圖2 細菌型水豆豉前發酵（A）及后發酵（B）樣品16S rDNA PCR擴增產物Fig.2 PCR products of 16S rDNA of bacterial water-Douchi samples in pre-fermentation (A) and post-fermentation (B)

圖3 細菌型水豆豉前發酵（A）及后發酵（B）樣品16S rDNA V3區序列PCR擴增產物Fig.3 PCR products of 16S rDNA V3 region sequences of bacterial water-Douchi samples in pre-fermentation (A) and post-fermentation (B)

2.3 DGGE結果分析

通過quantityone 4.6.2軟件處理DGGE結果，結果見圖4。對不同發酵時間的DGGE條帶數進行統計，結果見圖5。選取條帶明亮清晰度高的24條條帶進行測序、鑒定，鑒定結果見表1。各個發酵時期水豆豉樣品中細菌的分布見圖6。

圖4 細菌型水豆豉樣品16S rDNA V3區序列PCR擴增產物的DGGE圖譜Fig.4 DGGE map of PCR products of 16S rDNA V3 region sequences of bacteria in bacterial water-Douchi samples

圖5 細菌型水豆豉樣品16S rDNA V3區序列PCR擴增產物的DGGE條帶數Fig.5 DGGE band numbers of PCR products of 16S rDNA V3 region sequences of bacterial water-Douchi samples

表1 DGGE條帶鑒定結果Table 1 Identification results of DGGE band

續表

圖6 細菌型水豆豉樣品發酵過程中細菌的分布Fig.6 Distribution of bacteria in bacterial water-Douchi samples during fermentation

DGGE圖譜中每一泳道條帶的數量代表微生物的豐富度，亮度強弱代表細菌的數量。由圖4、圖5可知，在前發酵42 h后，細菌種類數量豐富并趨于穩定。后發酵第5天細菌種類最多，推測是由于后期加輔料時帶入的外源細菌。由表1可知，24條條帶中有3條只能鑒定到屬，4條為未培養克隆細菌。整個發酵時期共鑒定出6個屬共15個種，分別為芽孢桿菌屬、沙雷菌屬、產堿菌屬、腸球菌屬、不動桿菌屬以及變形桿菌屬。由圖4及圖6可知，枯草芽孢桿菌存在水豆豉的整個發酵期間，且數量最多，為主酵細菌。解淀粉芽孢桿菌一直存在發酵過程中，屬于優勢菌。前發酵18 h后出現熱噬淀粉芽孢桿菌，分析可能由于曲溫達到50 ℃左右，適宜嗜熱細菌的生長，而其他一些不適宜高溫的微生物則被抑制。同時，從中共檢測到6種條件致病菌，分別為粘質沙雷菌（Serratia marcescens）、糞產堿菌（Alcaligenes faecalis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）與鮑氏不動桿菌（Acinetobacter baumannii）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）。其中，粘質沙雷菌與糞產堿桿菌只存在前發酵0～6 h，推測可能是發酵前帶入的菌或發酵室環境污染。鮑曼不動桿菌、蠟樣芽孢桿菌、奇異變形桿菌、屎腸球菌在前發酵第66小時以及后發酵階段被檢出，推測可能是由于添加輔料時污染或輔料本身帶有。其中，P.mirabilis首次被發現存在于貴州細菌型水豆豉中。檢測到的屎腸球菌有較強的產酪胺和苯乙胺的能力[20]，而芽孢桿菌屬產尸胺，變形桿菌屬產組胺，沙雷氏菌屬產腐胺[21]。在豆豉發酵過程中，這4個菌屬細菌的存在影響貴州水豆豉生物胺含量。鮑氏不動桿菌是目前臨床上較為常見的條件致病菌。有研究發現，大蒜素對鮑氏不動桿菌有抑菌作用[22]。而蠟樣芽孢桿菌在10 ℃以下時停止繁殖，在100 ℃條件下處理20 min可被殺死，生長最低水分活度為0.95[23]。因此，豆豉發酵可以通過添加抑菌性輔料（如大蒜素、辣椒、鹽等）或控制發酵條件（如溫度、濕度、含氧量等）[21-23]抑制甚至殺死原料中本身帶有或后期帶入的（條件）致病菌，對工業化生產豆豉的污染菌防控具有理論指導意義。

3 結論

通過PCR-DGGE技術研究發現，純種強化發酵水豆豉前發酵42 h后，細菌種類及數量豐富并趨于穩定，后發酵第5天，細菌種類達到最大。從中共鑒定出6個屬15個種，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、沙雷菌屬（Serratia）、產堿菌屬（Alcaligenes）、腸球菌屬（Enterococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）以及變形桿菌屬（Proteus）。整個發酵期間共檢測出6種條件致病菌，分別為粘質沙雷菌（Serratia marcescens）、糞產堿菌（Alcaligenes faecalis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）與鮑氏不動桿菌（Acinetobacter baumannii）、屎腸球菌（Enterococcus faecium），其中，奇異變形桿菌首次報道存在于貴州純種發酵細菌型水豆豉。證實純種強化發酵水豆豉有條件致病菌污染，具有潛在的食品安全隱患，因此，在水豆豉發酵過程加強注意環境衛生、控制發酵條件可避免條件致病菌的產生。