四川省攀西地區山羊泰勒蟲病血清學檢測

郝桂英，袁曉琴，陳永航，莫 全，嚴光文，李鳳琴，楊應東，萬 潔，文建國，吉色曲伍

（1.西昌學院動物科學學院，四川西昌 615013；2.攀枝花市農林科學研究院畜牧水產所，四川攀枝花 617061；3.涼山彝族自治州農業農村局，四川西昌 615000）

山羊泰勒蟲?。╟aprine theileriosis）是由頂復門（Apicomplexa）梨形蟲綱（Piroplasmea）梨形蟲目（Piroplasmida）泰勒科（Theileriidae）泰勒屬（Theileria）的原蟲寄生于山羊巨噬細胞、淋巴細胞和紅細胞內所引起的一類由媒介蜱傳播的血液原蟲病[1]。該病主要發生于熱帶、亞熱帶和溫帶地區，呈地方性流行，以高熱、貧血、消瘦、體表淋巴結腫大為主要臨床特征，可引起羔羊和外地引進羊大量死亡，使慢性發病羊發育遲緩，產肉量顯著下降，給養羊業造成巨大經濟損失，嚴重制約養羊業發展[2]。

我國流行的羊泰勒蟲主要是尤氏泰勒蟲（T.uilenbergi）、呂氏泰勒蟲（T.luwenshuni）和綿羊泰勒蟲（T.ovis）[3]。由于泰勒蟲病為蜱傳性疾病，因此該病的流行隨媒介蜱的分布和活動，呈現出明顯的地方性和季節性特征。羊泰勒蟲病在新疆、內蒙古、遼寧、吉林、甘肅、青海、寧夏、河北、河南、山西、陜西、山東、湖北、浙江、江蘇、廣東、貴州、重慶、四川等19 個省市區均有報道。近年來，隨著養羊業的迅速發展，我國羊泰勒蟲病的發生呈上升趨勢。而該病在自然感染病例中常為隱性感染，因而增加了該病的防控難度[4]。

血涂片鏡檢法常用于泰勒蟲病的診斷，然而其靈敏性低，所以檢出率也低，易出現漏檢和誤診，在檢測領域受到一定的限制。隨著免疫學和分子生物學技術的發展，越來越多的檢測方法被建立并用于泰勒蟲病檢測，其中酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）具有較好的特異性和靈敏性，操作簡便，易于標準化，對試驗條件要求不高，更適于基層實驗室大量血清樣品的檢測，因此被廣泛用于流行病學調查研究[5-7]。

攀西地區位于四川省西南部，在安寧河、金沙江和雅礱江交匯處，山場廣闊，是四川省養羊的傳統產區之一，在全省養羊業中具有舉足輕重的地位。隨著農業產業結構調整，養羊業已成為攀西地區脫貧致富的主要途徑。目前，羊散養在攀西地區仍占主導地位，且蜱在該地區分布廣泛，因此該地區養羊業受到泰勒蟲病的潛在威脅。迄今，僅見郭淑珍等[8]報道，2001—2002 年涼山彝族自治州羊泰勒蟲病發病率為70%（35/50），死亡率為40%（20/50）。為了解四川省攀西地區山羊泰勒蟲病流行情況，采用雙抗原夾心ELISA 方法，對采自涼山州和攀枝花市的640 份山羊血清進行泰勒蟲病血清學檢測，以期為當地羊泰勒蟲病防制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清 2013 年11月—2019 年12月，在四川省涼山州西昌市（427 份）、布拖縣（36 份）、會理縣（31 份）、會東縣（20 份）、美姑縣（10 份）、寧南縣（20 份）、普格縣（36 份）、鹽源縣（19份），以及攀枝花市米易縣（19 份）、鹽邊縣（22 份）等10 個縣/市，無菌采集640 份山羊血，其中136份采集自西昌市養羊場，其余樣品均采自羊散養戶。待血液凝固析出血清后，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，編號后于-20 ℃保存備用。

1.1.2 主要試劑 羊抗泰勒蟲病ELISA 檢測試劑盒，購自北京綠源伯德生物科技有限公司，其抗原為呂氏泰勒蟲重組表達表面蛋白（rTlSP）。

1.2 方法

1.2.1 雙抗原夾心ELISA 法檢測 根據羊抗泰勒蟲病ELISA 檢測試劑盒說明書進行操作。使用前，將試劑盒置于室溫平衡20 min 后，取出所需量酶標板條，設空白對照1 孔，陰性及陽性對照各2 孔。在陰、陽性對照孔，分別加入陰、陽性對照各50 μL；在待測樣品孔，先加待測血清10 μL，再加樣本稀釋液40 μL；隨后在陰、陽性對照孔和待測樣品孔中，每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗原100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃溫育1 h。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min。甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5 次。每孔加入底物液A、B 各50 μL，37 ℃避光溫育15 min。每孔加入終止液50 μL，用空白孔調零，在450 nm波長處測定各孔吸光值（OD值）。

1.2.2 結果判定 試驗有效性：陽性對照孔OD平均值≥1.00，陰性對照孔OD 平均值≤0.15。臨界值（cut-off）計算：臨界值=陰性對照孔OD 平均值+0.15。結果判定：樣品OD 值＞臨界值，為血清抗體陽性，反之為陰性。

1.2.3 數據分析 采用SPSS 22.0統計分析軟件，對不同地區和季節的檢測結果進行卡方檢驗。P＜0.05 為差異顯著，具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同地區

攀西地區10 個縣/市羊泰勒蟲血清抗體陽性率介于52.78%～100%，平均陽性率為73.44%（表1），表明該地區羊泰勒蟲病流行較嚴重。經卡方檢驗，10 個縣/市的羊泰勒蟲血清抗體陽性率差異顯著（χ2=54.392，P＜0.01），表明該地區羊泰勒蟲病呈現一定的區域分布特點。

表1 不同縣/市羊泰勒蟲病血清學檢測結果

2.2 不同季節

按不同季節進行分組比較，春季（3月—5月）、夏季（6月—8月）、秋季（9月—11月）、冬季（12月—次年2月）血清抗體陽性率介于65.42%～95.24%，其中春季最高、秋季最低（表2）。經卡方檢驗，不同季節血清抗體陽性率差異顯著（χ2=38.157，P＜0.01），表明該地區羊泰勒蟲病呈現較明顯的季節性特征。

3 討論

我國存在的長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）和青海血蜱（H.qinghaiensis）均能傳播尤氏泰勒蟲和呂氏泰勒蟲[9]，小亞璃眼蜱（Hyalomma anatolicum anatolicum）可傳播綿羊泰勒蟲[10]。我國大部分地區均有不同程度地羊泰勒蟲病流行，因此羊放牧時被蜱叮咬而感染的風險較高。攀西地區林草資源豐富，為蜱的滋生提供了有利的環境，因而導致該地區羊泰勒蟲病流行率較高。

表2 不同季節羊泰勒蟲病血清學檢測結果

ELISA 是目前應用最廣泛的羊泰勒蟲病血清學檢測方法。目前已建立了幾種基于裂殖子粗抗原和重組抗原的間接ELISA 方法，用于泰勒蟲抗體檢測。Gao等[5]基于泰勒蟲裂殖子粗抗原建立的間接ELISA 方法，可檢測尤氏泰勒蟲和呂氏泰勒蟲，但與羊巴貝斯蟲有交叉反應，還存在標準化難、需要感染實驗動物以獲取制備抗原等缺點。Guo等[11]用裂殖子粗抗原間接ELISA 方法，對甘肅省甘南藏族自治州7 個地區進行泰勒蟲病流行情況調查，發現甘南地區泰勒蟲平均陽性率為70.1%，不同地區陽性率介于27.8%～83.3%。Niu等[12]用裂殖子粗抗原間接ELISA 方法，對采集自遼寧遼陽、河北興隆、內蒙古通遼、四川秦嶺以及甘肅天祝、甘南等地共1 234 份羊血清進行泰勒蟲檢測，發現總陽性率為66.78%（824/1 234），各地陽性率介于0～80.9%，其中甘南地區陽性率為71.3%，遼陽、興隆、通遼的陽性率均為0。

其他檢測小反芻動物泰勒蟲病的ELISA 方法均是基于重組表達抗原建立的。Miranda等[13]用克隆表達的Theileriasp.（China）熱休克蛋白70（TcHSP70）作為抗原建立的間接ELISA方法雖然與環形泰勒蟲（T.annulata）無交叉反應，但并沒有用田間樣品進行驗證。Bakheit等[14]用萊氏泰勒蟲裂殖子Clone-5 基因的重組表達蛋白作為抗原建立了間接ELISA 方法（Clone-5XP2 ELISA），其敏感性和特異性分別為94.6%和88.0%，與分離自我國的泰勒蟲和考德里氏體屬（Cowdriaspp.）無交叉反應。Liu等[15]基于尤氏泰勒蟲重組免疫蛋白（rTuIP）建立的間接ELISA 方法的特異性和靈敏性分別為98.44%和97.92%，僅與呂氏泰勒蟲有交叉反應，與萊氏泰勒蟲、巴貝斯蟲未定種、羊無形體無交叉反應。后來，Liu等[16]用rTuIP-ELISA 方法，對湖北隨州、貴州貴陽以及甘肅天祝和麻當的羊泰勒蟲病流行情況進行調查，發現陽性率分別為17.8%、11.6%、97.4%、97.0%，認為rTuIP-ELISA 方法可作為呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲流行病學調查的工具。Abdo等[17]基于尤氏泰勒蟲裂殖子cDNA 文庫的表面蛋白（Clone-9）建立了間接ELISA（rc9b-ELISA）方法，發現其靈敏性和特異性分別為87.7%和57.1%，與rTuIP-ELISA 的陽性符合率為85%。李有全等[18]以呂氏泰勒蟲重組表達表面蛋白（rTlSP）作為抗原建立的間接ELISA 方法與綿羊泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、環形泰勒蟲、東方泰勒蟲（T.orientalis）、中華泰勒蟲（T.sinensis）有交叉反應，但與巴貝斯蟲無交叉反應。He等[6]報道rTlSP-ELISA 方法的特異性和靈敏性分別為97.9%和97.1%，并用該方法對采集自甘肅省的240 份綿羊血清進行檢測，發現陽性率（63.75%）高于血涂片鏡檢陽性率（46.67%）。Li等[19]用rTlSPELISA 方法，對采集自吉林、遼寧、內蒙古、河北、山東、山西、安徽、浙江、陜西、甘肅、寧夏、青海、新疆、重慶、四川、西藏、湖南、貴州、云南、廣西、廣東等21 個省區市的2 351 份羊血清進行檢測，發現平均陽性率為41.0%（965/2 351），其中甘肅省陽性率最高，為76.0%，四川省為18.7%，河北省為0。Li等[20]用rTlSP-ELISA 方法，對我國北方牛泰勒蟲病成功進行了血清學調查。

盡管已經建立了多種羊泰勒蟲病血清學診斷方法，但血清學檢測存在不能區分耐過動物，不易區分相近蟲種的交叉感染而出現假陽性等缺點，目前還沒有一種血清學方法能明確、特異地區分呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲。而與基于DNA 的分子生物學方法相比，ELISA 具有成本更低、更易操作等優點，在大規模流行病學研究中具有很高的適用性。

本次檢測用rTlSP 抗原包被的雙抗原夾心ELISA，對攀西地區的羊血清進行檢測，發現攀西地區山羊泰勒蟲血清抗體陽性率為73.44%，高于青海等地的報道。李英等[21]用ELISA 方法，對青海天峻地區綿羊群進行泰勒蟲病血清學調查，發現血清抗體陽性率為18.68%（17/91）。尕松代吉[22]用ELISA 方法，對青海玉樹州羊群進行泰勒蟲病血清學調查，發現血清抗體陽性率為49.74%（382/768）。本次檢測發現，攀西地區10 個縣/市的羊泰勒蟲血清抗體陽性率介于52.78%～100%，地區差異顯著。這些地區差異可能與不同地區蜱的分布以及蜱的泰勒蟲攜帶率不同有關。

本次檢測結果與秦思源等[23]對甘肅省瑪曲不同季節牦牛雙芽巴貝斯蟲感染結果基本一致，但與Guo等[11]報道的甘肅省甘南藏族自治州羊泰勒蟲抗體檢測結果稍有差異。甘肅甘南藏族自治州羊泰勒蟲抗體的血清陽性率從3月份開始上升，到5月份達到最高（68.2%），10月份開始下降，到次年1月份降至最低（36.4%）。這是因為不同地區蜱的活動時間并不一致。攀西地區春季和夏季陽性率高于秋季和冬季，可能與春季和夏季的氣候條件更適合蜱的生存與繁殖有關。

本次檢測發現，攀西地區羊泰勒蟲血清抗體陽性率較高（73.44%）。這提示有關部門應加強監測并采取滅蜱等措施，以控制該病的流行與傳播。本檢測初步了解了羊泰勒蟲病在攀西地區的分布及流行狀況，但由于采樣時間和采樣數量的局限，檢測結果并不能全面真實反映該病的流行與分布情況，但可以為該病的防制提供一定的參考。

4 結論

檢測表明，攀西地區羊泰勒蟲病流行較為嚴重，且呈現明顯的地區和季節性暴發特點，因此在高發地區和高發季節，應采取監測和滅蜱等措施來控制該病流行。