豬血凝性腦脊髓炎病毒實時熒光RT-PCR 檢測方法的建立與應用

張 慧，張安潔，張 鋒，尼 博，劉 爽，崔 進，董雅琴，李曉成，魏 榮

（1.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；2.云南農業大學動物醫學院，云南昆明 650201）

豬血凝性腦脊髓炎病毒（porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV）屬于冠狀病毒科β 冠狀病毒屬，1962 年在加拿大首次被分離到[1]。豬是PHEV 唯一自然易感動物，所有年齡的豬對其均易感，3～4 周齡以下仔豬感染后較易出現臨床癥狀，表現為厭食、嘔吐、沉郁、肌肉顫抖等，最后消瘦、死亡，致死率可高達100%[2-3]。血清學調查[3-4]顯示，該病的隱性感染在我國及世界各地普遍存在。鑒于目前尚無疫苗可用及基因變異的潛在威脅，該病的病原學診斷非常重要。本研究建立了PHEV 快速、特異、敏感的實時熒光RT-PCR 檢測方法，并進行了臨床樣品檢測的初步應用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

超凈工作臺：美國Forma Scientific 公司；移液器：Eppendorf；渦旋振蕩器：美國Scientific Industries 公司；熒光定量PCR 儀：Bio-Rad CFX96 Real-time PCR System；核酸提取儀：德國QIAGEN 公司；電泳儀：Bio-Rad 公司；凝膠成像系統：Bio-Rad GelDoc EZ。

HiScript II U+One Step qRT-PCR Probe Kit，2×TaqMaster Mix（Dye Plus）：諾唯贊生物科技有限公司；Evo M-MLV 一步法RT-PCR 試劑盒：艾科瑞生物工程有限公司；核酸提取試劑盒：德國QIAGEN 公 司；Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip、Optically clear flat 8 Cap Strips：Bio-Rad 公司。異丙醇、無水乙醇等，均為國產分析純試劑。

1.2 引物、探針設計及陽性質粒合成

GenBank 中下載不同國家、不同分離時間的PHEV 毒株結構蛋白（S、M、N、HE）基因序列，采用MEGA 6.0 進行序列比對，選擇加拿大分離株（GenBank 登錄號AF481863）N 蛋白基因為參考序列，用primer express 3.0.1 軟件設計引物和探針。將該N 蛋白基因序列送至華大基因公司合成并克隆至Puc57 質粒，構建重組質粒Puc57-PHEVn。

1.3 反應條件優化

依次選擇PHEV-f、PHEV-r 終濃度0.9、0.3、0.1 μmol/L，probe 終濃度0.05、0.15、0.25 μmol/L，退火溫度56、57、58 ℃進行正交試驗，優化反應條件。配制反應體系20 μL：2×One Step U+Mix 10 μL、One Step U+Enzyme Mix 1 μL，引物和探針按終濃度加入，陽性質粒Puc57-PHEVn（34 ng/μL）1 μL，RNase free ddH2O 補齊至20 μL。RT-PCR 反應條件為：第1 階段，55 ℃15 min；第2 階段，95 ℃ 30 s；第3 階段，95 ℃10 s，56～58 ℃ 30 s，40 個循環。

1.4 敏感性和特異性評估

先將Puc57-PHEVn 稀釋至1 ng/μL，之后依次10 倍稀釋至10-1～10-7ng/μL；取1 μL 作為反應模板，按照1.3 中優化好的反應條件進行實時RT-PCR 反應，評估敏感性；每個梯度重復2 次，并繪制標準曲線。提取豬繁殖與綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環病毒2 型（PCV2）核酸，評估該方法的特異性。

1.5 臨床樣品檢測

采集山東、廣西、河南、江西等地發病豬組織樣品共計233 份，加入PBS（pH7.2）緩沖液勻漿，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min；取上清提取病毒核酸，加入上述反應體系進行實時RT-PCR。同時，參照Sekiguchi等[2]2004 年建立的巢式PCR 方法，對樣品核酸進行平行檢測，并將擴增目的片段送華大基因測序，同時與本試驗建立方法進行結果比對，計算兩種方法的符合率。

2 結果與分析

2.1 引物和探針篩選

最終篩選出的上下游引物和探針序列見表1。探針5'端進行熒光基團Texas red 標記，3'端進行淬滅基團BHQ2 標記。

表1 引物及探針序列

2.2 反應條件優化

以Puc57-PHEVn為模板，采用“四因素三水平”正交試驗進行實時熒光RT-PCR 反應，得出最佳反應條件為PHEV-f、PHEV-r 終濃度均為0.9 μmol/L，probe 終濃度為0.25 μmol/L，退火溫度為56 ℃時，熒光信號最強，起峰較早，擴增曲線最明顯（圖1）。

圖1 反應條件優化結果

2.3 敏感性和特異性

篩選的引物和探針在優化的反應條件下，檢測的Puc57-PHEVn 靈敏度為10-6ng/μL。按照公式DNA 拷貝數/μL=[6.02×1023×DNA 濃度（ng/μL）×10-9]/（DNA 堿基數×660），計算出的拷貝數為224 拷貝/μL（圖2）。標準曲線見圖3，擴增效率E=93.6%，R2=0.998。特異性試驗結果顯示，僅有陽性質粒Puc57-PHEVn 有明顯擴增曲線，上述其他病毒及陰性對照均未出現擴增曲線（圖4）。

2.4 臨床樣品檢測

圖3 PHEV 實時熒光RT-PCR 標準曲線

圖4 PHEV 實時熒光RT-PCR 特異性試驗結果

Ct ≤36 且出現典型擴增曲線，判為陽性；36 ＜Ct ＜40 且出現典型擴增曲線，重復檢測仍為陽性，則判為陽性，否則為陰性；無Ct 值且無擴增曲線，判為陰性。用建立的實時熒光RT-PCR，對233 份發病豬組織樣品進行檢測，結果18 份為陽性，而巢式RT-PCR擴增并測序陽性的為14份（表2），兩種方法符合率為98.3%。部分巢式RT-PCR結果見圖5，最終擴增片段為110 bp。

表2 兩種方法臨床樣品檢測結果 單位：份

圖5 巢式RT-PCR 檢測部分樣品電泳圖

3 討論

PHEV 已在世界范圍內流行[5]，其基因組的結構特點及其獨特的套式系列轉錄方式決定其容易發生變異和進化，致使其致病性和抗原性復雜多變[1]。雖然本研究在采自山東、廣西、河南、江西等地的樣品中均檢出陽性，但該病臨床暴發的報道卻不多。豬群感染PHEV 后，3～4 周齡仔豬較易出現臨床癥狀，而母豬及育肥豬可針對病毒產生較強的體液免疫，母豬還可通過初乳對仔豬提供免疫保護，這可能是世界范圍內PHEV 臨床暴發并不多的原因[3，6-7]。我國僅吉林省和臺灣地區報道過該病的暴發[8-10]。本研究所用臨床樣品為發病豬組織樣品，在檢出PHEV 的同時，均有PRRSV、PRV或PEDV等病毒檢出。PHEV 與這些病原的相關性仍需進一步研究。因此，隨著病毒的變異及養殖模式的變化[2-3]，PHEV 對豬群仍有一定的威脅。

目前，國內外已建立了針對PHEV 的RTPCR[6，9]及巢式RT-PCR 方法[2]，但這些方法均耗時較長。臧德躍等[11]根據PHEV S 蛋白基因建立了SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法。該方法具有快速、特異、敏感和重復性好等優點，為疾病早期快速診斷提供了良好的技術手段。目前國內尚未有PHEV 探針法熒光定量RT-PCR 方法的報道。本研究根據N 蛋白基因建立的PHEV 熒光定量RT-PCR 探針法，對陽性質粒的檢測下限達10-6ng/μL，即224 拷貝/μL。將該方法與巢式RTPCR 同步應用于臨床檢測，結果兩種方法的符合率達98.3%，準確篩查出巢式RT-PCR 并測序陽性的14 份樣品，且實時熒光RT-PCR 檢出率為7.7%（18/233），高于巢式RT-PCR 的6.0%（14/233），敏感性和重復性均較好。該方法的建立補充了現有PHEV 的分子生物學檢測方法，為該病的有效防控提供了技術支撐。