利用漆酶-天然介體系統高效降解土霉素

湯星陽, 夏 穎, 楊彬彬, 夏黎明

(浙江大學 化學工程與生物工程學院, 浙江 杭州 310027)

1 前 言

土霉素(oxytetracycline，OTC)是在禽、畜養殖業中最常用的四環素類抗生素[1]，可通過抑制蛋白質合成對立克次氏體、支原體、衣原體等多種病原菌產生抑制作用[2-3]。許多抗生素在動物腸道內吸收較差，通常會有30%～90%的母體化合物隨動物糞便進入到自然環境的水體和土壤中[4]。LI 等[5]通過研究發現渭河流域的四環素類抗生素殘留量處于中等水平，其中土霉素的殘留量最高(1.56～87.89 ng·L-1)。JIANG 等[6]研究了河北省海河流域中16 種抗生素的含量，發現水體中土霉素含量高達3.6×105ng·L-1。目前食品中檢出的抗生素含量常常遠超食品藥品監督管理局規定的標準[7]，而長期食用抗生素含量超標的食物會嚴重危害人體健康。

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一類多酚氧化酶[8]，由于其作用底物廣泛，可用于多種有機污染物(包括農藥、抗生素等)的降解[9-10]，在環境治理方面具有重要的應用價值。由于漆酶不能直接氧化具有相對較高氧化還原電勢(＞ 1.3 V)的非酚類底物[11]，通常需要有小分子介體物質參與反應，如人工合成介體2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、1-羥基苯丙三唑(HBT)、N-羥基-N-乙?；桨?(NHA)等[12]，但人工介體價格較高且有可能對環境造成二次污染，在實際應用中具有局限性[13]。已發現木質素降解過程中產生的小分子酚類衍生物如丁香醛、香草醛、香草酮、乙酰丁香酮等可以提高漆酶的催化活性[14]，采用此類天然介體替代人工合成介體，不僅可以大幅度降低成本、而且使用更加安全，在漆酶的規?；瘧梅矫婢哂兄匾饬x。

本文以土霉素為漆酶的作用底物，研究多種介體對漆酶催化反應的影響，并通過不同介體間的適當組合，構建漆酶-天然介體系統以實現對土霉素的高效降解。

2 材料與方法

2.1 試劑

鹽酸土霉素(CAS 2058-46-0，≥98%)購自上海吉至生化科技有限公司；香草醛(Van)、丁香醛(Syr)、阿魏酸(FA)、對香豆酸(PCA)、香草酮(Vanillone)、1-羥基苯并三唑(HBT)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為分析純以上。

2.2 粗酶液的制備

以水稻秸稈為基質，接入彩絨革蓋菌(Trametes versicolor)固態發酵培養10 d[15]，取酶曲后以1:5 的固液比加入pH 4.8 的檸檬酸緩沖液浸泡過夜，過濾離心后取上清液即為粗酶液。

2.3 漆酶對土霉素的降解實驗

在漆酶降解土霉素反應體系中，5 mL 反應體系內含 20 mg·L-1的土霉素，0～0.5 mmol·L-1的介體(丁香醛、香草醛、阿魏酸、對香豆酸、香草酮、ABTS、HBT)，200 mmol·L-1pH 2.5～7.0 的檸檬酸緩沖液以及 0～0.2 IU·mL-1的粗制漆酶液，于 25～70 ℃水浴搖床中 120 r·min-1條件下反應 0～5 h。

2.4 分析測定方法

2.4.1 漆酶活力的測定

采用 ABTS 法，以 2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為底物，取適當稀釋的酶液 50 μL，加入 950 μL pH 4.0 的檸檬酸緩沖液，30 ℃下加入 2 mmol·L-1ABTS 溶液 1 mL 混勻，于 420 nm 處測定 2 min 內吸光值變化，每分鐘消耗 1 μmol ABTS 所需的酶量定義為一個漆酶活力單位(IU·mL-1)[15]。

2.4.2 高效液相色譜法檢測土霉素

取反應結束的樣品1 mL 過0.45 μm 水膜，利用高效液相色譜儀(Agilent 1200,USA)進行檢測，流動相為 0.01 mol·L-1草酸水溶液:乙腈:甲醇 = 7:2:1，Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)色譜柱，流速 0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長355 nm，進樣體積20 μL，外標法定量。土霉素降解率計算如下：

式中：C0為反應前土霉素的濃度，C1為降解反應后土霉素的濃度。

3 結果與討論

3.1 不同介體對漆酶降解土霉素的影響

以土霉素為作用底物，介體添加量為0.3 mmol·L-1，研究多種介體(ABTS、HBT、丁香醛、香草醛、阿魏酸、對香豆酸、香草酮)對漆酶降解土霉素的影響，從圖1 可以看出：天然介體丁香醛和香草醛對漆酶降解土霉素具有明顯的促進作用，其效果比常用的人工合成介體ABTS、HBT 更好。丁香醛和香草醛都是木質素降解過程中產生的中間產物，利用此類天然介體在降解土霉素過程中替代人工合成介體，不僅可大大降低成本，而且對環境更加友好，具有良好的實際應用價值。

3.2 介體濃度對漆酶降解土霉素的影響

選取ABTS、丁香醛和香草醛 3 種介體，考察介體濃度(0.1～0.5 mmol·L-1)對漆酶降解土霉素的影響，結果如表 1 所示，ABTS 的適宜濃度為 0.4 mmol·L-1，而對于丁香醛和香草醛，在濃度0.1～0.3 mmol·L-1，土霉素降解率隨著介體用量的增加而提高，在0.3 mmol·L-1時達到最大，分別為62.98% 和64.68%，是漆酶-ABTS 系統的1.35 和 1.38 倍。

圖1 不同介體對漆酶降解土霉素的影響Fig.1 Effects of different mediators on oxytetracycline degradation by laccase

表1 介體濃度對土霉素降解率的影響Table 1 Effects of mediator concentrations on oxytetracycline degradation

3.3 漆酶-復合介體系統對土霉素的降解

以介體ABTS、丁香醛、香草醛為基礎，控制反應體系內介體總添加量為0.3 mmol·L-1，通過介體復配考察漆酶對土霉素的降解效果。如圖2(a)所示，在反應體系內添加復合天然介體丁香醛/香草醛(4:6)(記為Syr/Van)時，土霉素降解率可達95.14%，與漆酶-丁香醛和漆酶-香草醛介體系統比較時，漆酶-Syr/Van系統對土霉素的降解效果分別提高了51.06% 和47.09%，表明介體復配可有效提高漆酶對土霉素的降解，其中漆酶-Syr/Van 雙天然介體系統的效果最好。

圖2 漆酶-復合介體系統對土霉素的降解作用Fig.2 Oxytetracycline degradation catalyzed by the laccase-complex mediator system

圖2(b)顯示了漆酶-Syr/Van-ABTS 系統對土霉素的降解效果，在Syr/Van 復合物與ABTS 的比值為7:3 時，土霉素降解率最高可達96.12 %。雖然加入ABTS 后的3 介體系統可以提高漆酶對土霉素的降解率，但ABTS 屬于人工合成介體，在實際推廣應用中成本較高且可能對環境造成2 次污染。相比之下，采用漆酶-Syr/Van 雙介體系統在實際應用中更為經濟可行。

3.4 漆酶-Syr/Van 系統降解土霉素條件優化

3.4.1 最適溫度和pH

在反應體系內 Syr/Van 復合物(4:6)添加量0.3 mmol·L-1，漆酶用量0.1 IU·mL-1，25～70 ℃，120 r·min-1，pH 2.5～7.0，反應4 h，考察漆酶-Syr/Van 系統降解土霉素的最適溫度和pH，結果如圖 3 所示。在25～50 ℃，土霉素降解率隨著溫度升高而增加，在50 ℃時降解率達到最高(圖3(a))，由于彩絨革蓋菌所產漆酶具有較好的耐熱性[16]，漆酶-Syr/Van 系統可在寬泛的溫度范圍內實現對土霉素的有效降解。

圖3 溫度和pH 對漆酶-Syr/Van 系統降解土霉素的影響Fig.3 Effects of temperature and pH on oxytetracycline degradation catalyzed by the laccase-Syr/Van system

漆酶-Syr/Van 系統對pH 適應范圍較廣，在pH 3.0～6.0，土霉素降解率及反應結束后的剩余漆酶活力均可保持在60%以上。在pH 4.0～5.0，漆酶對土霉素的降解率可達到90% 以上，其中在pH 4.0 時，土霉素降解率最高(圖3(b))。

3.4.2 漆酶用量

在反應體系內 Syr/Van 復合物(4:6)添加量 0.3 mmol·L-1，漆酶用量 0～0.2 IU·mL-1，50 ℃，120 r·min-1，pH 4.0，反應4 h，考察不同漆酶用量對土霉素降解的影響，結果如圖4 所示：在0～0.1 IU·mL-1漆酶用量，土霉素的降解率隨著漆酶用量的增加而提高；在漆酶用量達到0.1 IU·mL-1之后，繼續增加漆酶用量不能進一步提高土霉素的降解率。

圖4 漆酶用量對漆酶-Syr/Van 系統降解土霉素的影響Fig.4 Effects of laccase dosage on oxytetracycline degradation catalyzed by the laccase-Syr/Van system

圖5 漆酶-Syr/Van 系統降解土霉素的時間進程Fig.5 Profiles of oxytetracycline degradation processes catalyzed by the laccase-Syr/Van system

3.5 漆酶-Syr/Van 系統降解土霉素的時間進程

在反應體系內 Syr/Van 復合物(4:6)添加量 0.3 mmol·L-1，漆酶用量 0.1 IU·mL-1，50 ℃，120 r·min-1，pH 4.0 條件下，反應0～5 h。定時取樣測定土霉素降解率，結果如圖5 所示：漆酶-Syr/Van 系統對土霉素的降解率1 h 內可達53%，反應4 h 后土霉素的降解率高達95.14%，與漆酶-ABTS 介體系統相比較，優勢十分明顯。

土霉素在土壤和水體中的檢出率很高，其具有并四苯結構，在自然環境中不易分解、殘留期較長[17]。WANG 等[18]利用微生物燃料電池研究土霉素在其中的降解和毒性變化，結果發現7 天內土霉素降解率可達78%，斑馬魚毒理實驗證明土霉素經降解后毒性明顯降低。本文采用漆酶-Syr/Van 系統，成功實現了對土霉素的高效降解，有望在環境污染治理領域發揮出重要作用。

4 結 論

利用漆酶介體系統可實現對土霉素的有效降解，發現木質素降解中間產物丁香醛(Syr)、香草醛(Van)在土霉素降解中可以作為天然介體替代常用的人工合成介體ABTS 和HBT，此類天然介體價格低廉、使用安全。發現復合介體的效果優于單一介體，構建了Syr/Van 雙介體復合物，采用漆酶-Syr/Van 系統4 h內對土霉素的降解率高達95.14 %。本研究結果具有重要的實際應用價值。