南瓜果實黃酮提取工藝條件優化及其抗氧化性研究

李娜，燕平梅，喬宏萍，張志軍，李曉君，賀東亮

(1.太原師范學院，山西 晉中 030619；2.中北大學，太原 030051；3.太原工業學院，太原 030008)

隨著現代社會經濟的快速發展，人們不僅局限于溫飽問題，更注重食品的綠色健康。南瓜又名金瓜、番瓜、飯瓜等，屬葫蘆科一年生草本蔓性植物[1]，富含β-胡蘿卜素、酚類、氨基酸、維生素、植物甾醇、微量元素以及生物黃酮等有效成分[2]。南瓜果實作為藥食兩用植物有著悠久的歷史，在食品及調味品領域有著廣泛的應用。

黃酮類物質廣泛存在于植物次級代謝產物中，易溶于水、乙醇、甲醇等溶劑中[3]，黃酮類化合物對維持血管正常滲透壓[4]、預防冠心病及心絞痛[5,6]、改善心血管功能、延緩衰老等均具有良好療效[7,8]，黃酮還有抗輻射、消除自由基、防衰老等多種藥理作用[9,10]，因此，作為天然食品添加劑、抗氧化劑、食用色素、食用調味品等[11-13]，在食品、調味品以及醫藥行業中應用尤為廣泛，對黃酮類化合物的研究已經成為全球學術界的研究熱點，但對南瓜果實黃酮類物質提取及應用的相關報道較少。因此，本試驗選擇超聲波輔助乙醇浸提法提取南瓜黃酮物質，該方法具有提取率高、提取時間短、不破壞有效成分等優點[14]。本研究旨在通過響應面法優化提取南瓜果實中黃酮物質的最佳工藝參數，同時考察南瓜果實黃酮提取物體外抗氧化活性，為進一步開發和利用南瓜資源提供了理論依據與技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將供試南瓜洗凈瀝干后切片置于60 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥72 h，冷卻后用密封袋密封后放置于干燥器中待用。

DPPH(分析純)、ABTS(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；其他有機溶劑：均為國產分析純。

1.2 試驗設計

單因素試驗分別考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、超聲時間(10，20，30，40，50 min)、乙醇濃度(10%、30%、50%、70%、90%)、超聲溫度(40，50，60，70，80 ℃)、浸泡時間(0，3，6，9，12 h)、粉粹粒徑(60，80，100，120，140目)對黃酮含量的影響。在單因素試驗基礎上，采用Design-Expert 8.0.6試驗設計方案，選擇乙醇濃度(X1)、超聲時間(X2)、超聲溫度(X3)為考察變量，以黃酮物質含量(Y)為響應值，其編碼水平見表1。

表1 超聲波提取南瓜黃酮類化合物響應曲面設計因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface design for ultrasonic extraction of flavonoids from pumpkin

1.3 黃酮含量測定

精確稱取一定量南瓜粉末于離心管中，加入相應體積的乙醇溶液在設定條件下浸提后，4000 r/min離心10 min后移取上清液備用。采用鋁鹽螯合顯色法測定南瓜果實黃酮含量[15]。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH·清除能力測定

將南瓜果實黃酮提取物稀釋至不同濃度，每個濃度的樣品取0.3 mL于試管中，加入2.7 mL60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，在室溫避光條件下反應30 min，于517 nm處測定吸光度值[16]。以含有0.3 mL甲醇和2.7 mL DPPH溶液為空白樣品，以Vc作為陽性對照。所有試驗重復3次。根據公式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：I為南瓜果實黃酮提取物對DPPH·的清除率；A0為DPPH空白對照的吸光度值；As為樣品與DPPH反應后的吸光度值。

1.4.2 ABTS+·清除能力測定

將過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)和ABTS溶液(7 mmol/L)以等體積混合，并于室溫下避光反應12～16 h，每次使用前用80%乙醇稀釋為ABTS工作液[17]，使其在734 nm處的吸光度值為0.7。設置一系列濃度的南瓜果實黃酮溶液，各取0.3 mL于試管中，加入2.7 mL稀釋過的ABTS工作液，輕輕晃蕩，搖勻，室溫避光條件下反應30 min，并測定734 nm處的吸光度，以濃度為80%乙醇溶液作為空白對照，以Vc為陽性對照，所有試驗重復3次。根據公式(2)計算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：I為南瓜果實黃酮提取物對ABTS+·的清除率；A0為ABTS空白對照的吸光度值；As為樣品與ABTS反應后的吸光度值。

1.4.3 清除羥基自由基試驗

取不同濃度的南瓜果實黃酮各0.3 mL于試管中，再加入H3PO4緩沖液2.0 mL，番紅2.0 mL，EDTA-Na2-Fe2+2.0 mL，最后加入2.0 mL的H2O2溶液，充分搖勻，并在40 ℃的水浴鍋中保持30 min，測定520 nm處的吸光度[18]，并使用EDTA-Na2-Fe2+溶液作為空白樣品，以Vc作為陽性對照，所有試驗重復3次。根據公式(3)計算羥基自由基清除率。

(3)

式中：Y為南瓜果實黃酮提取物對·OH的清除率；A0為不加樣品和H2O2，Ar為不加樣品，As為加樣品和H2O2。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

單因素對南瓜果實黃酮含量的影響分別見圖1中A～F。料液比、乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度、浸泡時間和粉碎粒徑對南瓜果實黃酮含量均呈現先升后降的趨勢。綜合考慮黃酮含量以及試驗成本等因素，確定料液比1∶20、乙醇濃度70%、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃、預浸泡時間6 h和粉碎粒徑120目為南瓜黃酮的最佳基本提取條件。

圖1 料液比、乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度、浸泡時間、粉碎粒徑對南瓜果實黃酮類化合物得率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratios, ethanol concentration, ultrasonic time, ultrasonic temperature, soaking time, crushing particle size on extraction rates of flavonoids from pumpkin fruits

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面模型及顯著性檢驗

將乙醇濃度(X1)、超聲時間(X2)、超聲溫度(X3)作為曲面響應法考察的3個單因素，以黃酮含量(%)為響應值，3因素3水平17個組合的響應曲面法分析試驗結果見表2。黃酮含量的變幅為1.28%(16號試驗)～3.57%(13號試驗)。

表2 試驗設計及響應值結果Table 2 Experimental design and response value results

續 表

2.2.2 黃酮含量的響應面分析

黃酮類物質的含量回歸模型的方差分析見表3。黃酮含量的二次多項式擬合模型極顯著(P<0.0001)，F值為60.54，其失擬項P=0.2292>0.05不顯著，因此，在試驗范圍內，此模型與試驗數據的擬合性較好；擬合系數R2值是0.9873。說明該模型能夠闡明98.73%響應值的變化。由此可以看出，可以用該模型對超聲溫度、乙醇濃度、超聲時間對黃酮類物質含量的影響進行優化和分析。

運用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中黃酮含量進行試驗數據的響應面回歸擬合，得出黃酮含量響應值(Y)和各因素(X1、X2、X3)間二次回歸模型Y=+3.41+0.14X1+0.046X2-0.13X3-0.73X1X2-0.70X1X3-0.21X2X3-0.73X12-0.44X22-0.66X32，此方程的方差分析和回歸分析見表3。

表3 二次多項式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial model

由表3可知，乙醇濃度-超聲時間交互項、乙醇濃度-超聲溫度交互項。乙醇濃度二次項、超聲時間二次項、超聲溫度二次項對黃酮含量呈現出極顯著水平；乙醇濃度一次項、超聲溫度一次項、超聲時間-超聲溫度交互項呈現出顯著水平；超聲時間一次項不顯著。

應用Design-Expert 8.0.6軟件，超聲時間和超聲溫度與黃酮含量之間的關系見圖2。

圖2 超聲時間和超聲溫度交互作用對南瓜果實黃酮類化合物得率影響的響應面及等高線圖Fig.2 Three-dimensional response surface and contour plot showing the interactive effect of ultrasonic time and ultrasonic temperature on the yield of flavonoids from pumpkin fruits

由圖2中A可知，當乙醇濃度不變時，黃酮含量隨著超聲溫度和超聲時間的升高呈現出先上升后下降的趨勢，當超聲溫度為60 ℃且超聲時間為30 min時，黃酮含量達到最大值。由圖2 中B可知，等高線圖接近橢圓形，說明超聲時間和超聲溫度之間交互作用顯著。

乙醇濃度和超聲溫度與黃酮含量之間的關系見圖3。

圖3 乙醇濃度和超聲溫度交互作用對南瓜果實黃酮類化合物得率影響的響應面及等高線圖Fig.3 Three-dimensional response surface and contour plot showing the interactive effect of ethanol concentration and ultrasonic temperature on the yield of flavonoids from pumpkin fruits

由圖3中A可知，在固定超聲時間不變的情況下，黃酮含量隨著超聲溫度與乙醇濃度的升高呈現出先上升后下降的趨勢。當乙醇濃度為70%且超聲溫度為60 ℃時，黃酮含量達到最大值。由圖3中B可知， 乙醇濃度和超聲與溫度之間交互作用顯著。

超聲時間和乙醇濃度與黃酮含量之間的關系見圖4。

圖4 超聲時間和乙醇濃度交互作用對南瓜果實黃酮類化合物得率影響的響應面及等高線圖Fig.4 Three-dimensional response surface and contour plot showing the interactive effect of ultrasonic time and ethanol concentration on the yield of flavonoids from pumpkin fruits

由圖4中A可知，在超聲溫度固定不變的情況下，黃酮含量隨著超聲時間和乙醇濃度的增加而先增加后下降，當超聲時間為30 min且乙醇濃度為70%時，黃酮含量達到最大值。由圖4中B可知，乙醇濃度和超聲時間之間交互作用顯著。

2.2.3 南瓜果實黃酮提取最優條件的確定及驗證

使用Design-Expert 8.0.6軟件得到提取南瓜果實黃酮的最佳方案為：乙醇濃度70%、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃，此條件下南瓜果實黃酮的含量達到3.4%。根據上述條件做驗證試驗，南瓜果實黃酮的平均含量為3.37%，其誤差為0.88%，接近預測值，表明南瓜果實黃酮含量的預測值與實測值之間具有良好的擬合性，充分驗證了所建模型的有效性，說明回歸方程能較真實地反映各因素對南瓜果實黃酮含量的影響。

2.3 南瓜果實黃酮提取物抗氧化性

2.3.1 DPPH·清除能力

南瓜黃酮和Vc清除DPPH·能力的試驗結果見圖5。

圖5 南瓜果實黃酮(A)和Vc (B)對DPPH·清除能力Fig.5 DPPH· scavenging ability of flavonoids from pumpkin fruits (A) and Vc (B)

結果表明，南瓜果實黃酮提取物(A)對DPPH·具有清除作用，但其清除能力顯著低于Vc(B)。DPPH·的清除率在南瓜黃酮提取物濃度為0.01～0.07 mg/mL的范圍內隨著濃度的增加而增加；當黃酮提取物濃度大于0.07 mg/mL時，DPPH·清除率的增幅較小，呈基本穩定狀態；當濃度為0.084 mg/mL時，對DPPH·清除率最高，為88.55%。

2.3.2 ABTS+·清除能力

南瓜黃酮和Vc清除ABTS+·的試驗結果見圖6。

圖6 南瓜黃酮(A)和Vc (B)對ABTS+·清除能力Fig.6 ABTS+ ·scavenging ability of flavonoids from pumpkin fruits (A) and Vc (B)

結果表明，南瓜果實黃酮提取物(A)能夠清除ABTS+·，但其清除能力顯著低于Vc (B)。ABTS+·的清除能力在南瓜黃酮提取物濃度為0～0.05 mg/mL的范圍內表現為上升趨勢，當濃度大于0.05 mg/mL后，隨著黃酮濃度繼續增加，ABTS+·的清除能力保持穩定。當黃酮濃度為0.072 mg/mL時，ABTS+·的清除率最高，為89.34%。

2.3.3 羥自由基清除能力測定

南瓜黃酮和Vc清除·OH的試驗結果見圖7。

圖7 南瓜黃酮(A)和Vc (B)對·OH清除能力Fig.7 ·OH scavenging ability of flavonoids from pumpkin fruits (A) and Vc (B)

結果表明，南瓜果實黃酮提取物(A)與Vc (B)對·OH都有清除作用，并且隨著南瓜黃酮濃度的增加，兩者都呈上升趨勢。當南瓜黃酮濃度為0.2 mg/mL時，清除率高達98.34%，高于相同濃度下Vc對·OH的清除率(98.25%)。

3 結論

在單因素試驗基礎上，通過響應面法設計優化了提取南瓜果實黃酮的3個關鍵因素，達到擬合性好的回歸模型并對其交互項進行了分析。確定最佳提取條件為：料液比1∶20、乙醇濃度70%、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃、預浸泡時間6 h、粉粹粒徑120目。此條件下南瓜果實黃酮提取率可達3.57%。通過抗氧化試驗研究，南瓜黃酮提取物對DPPH·、ABTS+·、·OH具有不同程度的清除作用，在設置的濃度范圍內，3種自由基的清除率與南瓜黃酮類化合物的濃度之間存在一定的量效應關系，當南瓜果實黃酮提取物濃度分別為0.084，0.072，0.2 mg/mL時，對DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率最大。本研究結果表明，南瓜果實黃酮作為一種天然的抗氧化劑，能夠在食品添加劑和調味品行業進行深入開發及應用，本研究結果為南瓜黃酮大規模產業化加工提供了一定理論依據和技術參照。