針闊混交林中興安落葉松比例對土壤化學性質和酶化學計量比的影響

王 博，周志勇，張 歡，朱 雍，曹雨松，趙洪濤

（1. 北京林業大學 森林資源與生態系統過程北京市重點實驗室，北京 100083；2. 北京自然博物館，北京100050）

興安落葉松Larix gmelinii是中國東北地區三大針葉樹種之一[1]，20世紀70年代成為該地區主要造林樹種，但由此也帶來了林分結構簡單、群落物種多樣性降低與森林地力衰退等一系列問題[2]。森林土壤養分含量的增加依賴于地表凋落物[3]和地下有機物的輸入，以及微生物進行的分解利用[4]，因此，森林生態系統的物質生產能力和樹種組成則是調控落葉松林土壤質量與養分利用狀態的關鍵生物因子[5]。研究清楚土壤養分含量及決定其周轉的微生物胞外酶的活性隨群落中興安落葉松所占比例的變化動態，對全面衡量東北地區針闊混交林在氣候變化情景下的演替趨勢具有重要的生態學意義。土壤酶是生化反應的催化劑[6]，土壤中生化反應的進行需要酶的參與[7]。土壤酶不僅是檢驗土壤質量變化的指標[8]，也是影響土壤碳(C)、氮(N)、磷(P)循環的主要限制因子[9]。土壤酶化學計量比反映土壤微生物對養分需求的差別，可以在一定程度上反映土壤養分的有效性[10]。與土壤C、N、P循環相關的酶主要有β-1,4-葡萄糖苷酶 [β-1,4-glucosidase(BG)]、β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 [β-1,4-N-acetylglucos-aminidase(NAG)]、亮氨酸氨基肽酶[leucine aminopeptidase(LAP)]、酸性磷酸酶[acid or alkaline phosphatase(AP)]、α-纖維素酶[α-cellulases (CBH)]，其中BG、CBH與纖維素降解有關，NAG與蛋白質水解有關。有效性氮的升高會導致NAG和LAP活性的降低，提高對其他養分元素分解酶的投入[11]，LAP與幾丁質和肽聚糖降解有關。AP與有機磷礦化有關。在土壤酶活性的基礎上，SINSABAUGH等[12]采用ln(xBG+xCBH)∶ln(xNAG+xLAP)∶ln(xAP) (x為酶活性)表示土壤酶化學計量比對土壤C∶N∶P化學計量比和土壤C、N、P循環的影響。土壤C∶N∶P化學計量比與土壤C、N、P循環有關[13]，土壤化學計量比可以反映土壤元素調節機制[14]，進而對植物生長和生理機能進行調控。前人研究大多集中在不同林齡、不同林型對土壤理化性質、土壤化學計量比等方面，例如：隨林齡的增加，土壤C∶P、N∶P增大，P成為限制因子[15]。土壤微生物通過分泌胞外酶從土壤中獲取需要的養分[16]，土壤微生物數量隨林齡增大而降低[17]。華北落葉松Larixprincipis-rupprechtii-白樺Betula platyphylla混交林土壤有機質、全氮、全鉀、全磷含量高于華北落葉松純林[18]，但對華北落葉松所占不同比例的針闊混交林的土壤酶化學計量比的研究較少。土壤中C、N、P等養分的有效性主要取決于與其礦化相關的水解酶的強弱。有研究表明：微生物胞外酶活性[8]及其化學計量比[12]是衡量土壤微生物和森林生態系統功能的重要生化指標。在森林生態系統中，土壤理化性質[19]、土壤酶活性[20]、土壤微生物群落結構及其功能[21]和土壤養分有效性[22]又受到樹種組成的影響。盡管大興安嶺地區森林群落結構相對簡單，但其優勢樹種興安落葉松和白樺在物質生產能力、凋落物性狀等方面存在較大的差異，隨著群落中興安落葉松所占比例的變化，量化不同群落的土壤養分狀況、土壤酶活性及其生態計量比，并以此為基礎探討興安落葉松所占比例與土壤生化性狀間的內在驅動機理，為客觀了解東北地區寒溫帶針闊混交林的演替趨勢提供理論依據。

1 研究方法

1.1 研究區概況

研究區域位于內蒙古自治區根河市根河國家濕地森林公園 (50°25′30″～51°17′00″N，120°41′30″～122°42′30″E), 屬寒溫帶大陸性氣候，晝夜溫差大，冬長夏短，年平均氣溫?5.3 ℃。土壤為酸性棕色針葉林土，土層淺，礫石含量高，且存在永凍層[23]，年降水量為450.0 ～550.0 mm[24]。主要喬木為興安落葉松、白樺。主要灌木為紅豆越橘Vaccinium vitis-idaea、山刺玫Rosa davurica、杜香Ledum palustre、興安杜鵑Rhododendron dauricum、篤斯越橘Vaccinium uliginosum等。主要草本為鹿蹄草Pyrola calliantha、地榆Sanguisorba officinalis、山芹Ostericum sieboldii等。

1.2 研究方法

2018年7月，為研究東北地區退化森林演替規律，在50°56.662 5′～51°00.748 3′N的范圍，從北向南，按照興安落葉松的長勢，對該區域林齡相近的興安落葉松群落進行了調查。每個地點調查3個20 m×20 m樣方，樣方之間間距為20 m。對布設樣地進行了每木檢尺，測量了群落內胸徑大于5 cm喬木的胸徑、樹高、冠幅，以及灌木、草本的蓋度、株數、高度等信息。按《中國立木材積表》計算每個森林群落內的樹木材積所占比例，并按興安落葉松占整個群落的材積比(70%、75%、80%、85%、90%、95%)把調查樣地分為了6個梯度，每個樣方內挖取3個剖面，取0～5、5～20 cm土樣，并在實驗室過2 mm篩。一部分風干測定土壤理化性質，一部分冷凍保存測定土壤酶活性和微生物量。

采用96微孔酶標板熒光分析法測定β-1,4-葡糖苷酶(BG)、α-纖維素酶(CBH)、β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、酸性磷酸酶(AP)活性[25]。稱取1 g鮮土放在1 000 mL燒杯中，加入125 mL 50 mmol·L?1的醋酸鈉緩沖液(pH=5), 渦旋振蕩1 min, 使用移液器向96微孔酶標板中分別對應加入250 μL緩沖液、200 μL土壤勻漿樣品、50 μL標物、50 μL底物。在培養箱以25 ℃黑暗條件下培養4 h 后，加入10 μL 1 mol·L?1的氫氧化鈉終止反應。采用多功能酶標儀(Spectramax 190) 測定其熒光度。

根據《土壤農業化學分析方法》測定土壤理化性質[26]。土壤pH用pH計測定(m土∶m水=1.0∶2.5)；土壤有機碳(SOC)采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化容量法測定，使用硫酸亞鐵溶液滴定；全氮(TN)、堿解氮(AHN)使用凱氏定氮儀測定；全磷(TP)采用高氯酸-硫酸(HClO4-H2SO4)消煮-鉬銻抗比色法測定；易氧化碳(EOOC)采用高錳酸鉀氧化法測定；土壤微生物量的測定采用氯仿熏蒸浸提法[26?27]。

1.3 數據分析

數據統計在R 3.5.3中完成, 使用R 3.5.3和SigmaPlot 12.5軟件作圖。土壤酶化學計量比采用ln(xBG+xCBH)∶ln(xNAG+xLAP)∶ln(xAP)(x為酶活性)表示。采用Pearson相關性分析土壤酶活性、土壤酶化學計量比與土壤理化性質之間的關系。采用Canoco 5軟件進行冗余分析(RDA)。

2 結果分析

2.1 生態酶活性及其化學計量比隨興安落葉松不同比例的變化特征

0～5 cm土層各梯度間AP、NAG、BG、CBH活性均無顯著差異，興安落葉松比例為95%的群落LAP活性比興安落葉松比例為75%和85%的群落顯著提高57.44%和59.40%。5～20 cm土層各梯度間AP、NAG、BG、CBH、LAP活性均無顯著差異。5種酶活性中AP酶活性最高，0～5與5～20 cm土層均值分別為 463.74 和 312.91 nmol·g?1·h?1(圖 1)。

圖1 不同比例興安落葉松林土壤酶活性指標Figure 1 Soil enzymatic activity in different L. gmelinii stands

0～5 cm土層土壤酶化學計量比C∶N、土壤酶化學計量比C∶P、土壤酶化學計量比N∶P均無顯著變化。5～20 cm土層土壤酶化學計量比C∶P無顯著差異，土壤酶化學計量比C∶N隨興安落葉松所占比例的增加先增加后降低，且興安落葉松比例為95%的群落顯著低于興安落葉松比例為80%和85%的群落(P95%-80%=0.030,P95%-85%=0.030)。土壤酶化學計量比N∶P隨興安落葉松所占比例的增加先降低后增加，且興安落葉松比例為70%和95%的群落顯著高于興安落葉松比例為80%、85%的群落(P70%-80%=0.020,P70%-85%=0.020,P95%-80%=0.020,P95%-85%=0.020) (圖 2)。

圖2 不同比例興安落葉松林土壤酶化學計量比Figure 2 Soil ecoenzymatic activity stoichiometry in different L. gmelinii stands

2.2 興安落葉松所占不同比例的針闊混交林土壤微生物量的變化

0～5 cm土層各梯度之間土壤微生物量碳(MBC)無顯著差異，興安落葉松比例為80%的群落MBC質量分數最低，最低值為525.10 mg·kg?1；興安落葉松比例為95%的群落MBC質量分數最高，最大值為1 035.80 mg·kg?1。5～20 cm土層興安落葉松比例為95%的群落MBC質量分數顯著高于興安落葉松比例為80%的群落(P95%-80%=0.040)。0～5 cm土層各梯度之間微生物量氮(MBN)無顯著差異，興安落葉松比例為80%的群落MBN質量分數最低，最低值為68.73 mg·kg?1；興安落葉松比例為90%的群落MBN質量分數最高，最大值為140.72 mg·kg?1。5～20 cm土層興安落葉松比例為95%的群落MBN顯著高于興安落葉松比例為80%和85% 的群落(P95%-80%=0.002,P95%-85%=0.040) (圖3)?？傮w上看，土壤微生物量隨興安落葉松所占比例的增加呈現先增加后降低再增加的趨勢。

圖3 不同比例興安落葉松林土壤微生物指標Figure 3 Soil microbial indexes in different L. gmelinii stands

2.3 興安落葉松所占比例不同的針闊混交林土壤的理化性質

表1和表2顯示：0～5與5～20 cm土層各梯度之間土壤pH無顯著差異。5～20 cm 土層，興安落葉松比例為95%的群落土壤有機碳(SOC)質量分數顯著高于興安落葉松比例為85%的群落(P95%-85%=0.030)。5～20 cm土層興安落葉松比例為95%的群落全氮(TN)質量分數顯著高于其他興安落葉松群落(P95%-70%=0.001,P95%-75%=0.007,P95%-80%=9×10?4,P95%-85%=0.001,P95%-90%=0.001)。0～5 cm 土層興安落葉松比例為95%的群落土壤全磷(TP)質量分數顯著高于興安落葉松比例為70%、80%、85%、90%的群落(P95%-70%=0.050,P95%-80%=0.001,P95%-85%=0.030,P95%-90%=0.040)，興安落葉松比例為75%的群落土壤TP質量分數顯著高于興安落葉松比例為80%的群落(P75%-80%=0.050)。5～20 cm土層興安落葉松比例為95%的群落TP質量分數顯著低于興安落葉松比例為80%的群落(P95%-80%=0.010)。5～20 cm土層興安落葉松比例為95%的群落易氧化碳(EOOC)質量分數顯著高于興安落葉松比例為70%的群落(P95%-70%=0.010)。0～5與5～20 cm土層各梯度之間堿解氮(AHN)和土壤C∶N均無顯著差異。0～5 cm土壤N∶P隨興安落葉松所占比例的變化呈現先降低后增加再降低的趨勢，興安落葉松比例為80%的群落顯著高于興安落葉松比例為95%、75%的群落(P80%-95%=0.010,P80%-75%=0.030)，5～20 cm土層土壤N∶P與5～20 cm土層 TP變化規律相反，興安落葉松比例為95%的群落土壤N∶P顯著高于興安落葉松比例為70%、80%、85%的群落(P95%-70%=0.020,P95%-80%=0.003,P95%-85%=0.003)。5～20 cm土壤C∶P呈現先增加后降低再增加的趨勢，興安落葉松比例為95%的群落顯著高于興安落葉松比例為70%、80%、85%的群落(P95%-70%=0.030,P95%-80%=0.006,P95%-85%=0.005)。

2.4 土壤微生物量、酶活性及土壤酶化學計量比影響因子分析

RDA排序圖結果(圖4)顯示：0～5 cm土層第1軸和第2軸的解釋變量分別為30.03%和12.86%(圖4A)，土壤pH(F=2.7，P=0.040)是土壤酶活性和酶化學計量比的顯著影響因子。5～20 cm土層第1軸和第 2軸的解釋變量分別為 42.86%和 17.17%(圖 4B)，土壤 TN(F=8.9，P=0.002)和 AHN(F=10.1，P=0.034)是土壤酶活性和酶化學計量比的顯著影響因子。表3和表4中土壤微生物量和酶活性與土壤理化性質之間相關性分析表明：在0～5 cm土層，土壤BG、CBH與AP，土壤NAG、LAP與AP呈顯著正相關 (PBG-AP=0.001,PCBH-AP=3×10?4,PNAG-AP=8×10?4,PLAP-AP=1×10?5) (表 3)。5～20 cm 土層土壤 MBC、MBN與SOC、TN、EOOC、CBH、NAG、AP、LAP顯著正相關(PMBC-SOC=0.020,PMBC-TN=2×10?4,PMBC-EOOC=2×10?4,PMBC-CBH=0.050,PMBC-NAG=0.020,PMBC-AP=0.050,PMBC-LAP=0.010, PMBN-SOC=0.010,PMBN-TN=4×10?7,PMBN-EOOC=3×10?6,PMBN-CBH=0.020,PMBN-NAG=3×10?4,PMBN-AP=0.003,PMBN-LAP=0.030) (表 4)。0～5 cm 土層BG、NAG與pH呈顯著負相關(PpH-BG=?0.010,PpH-NAG=?0.030)。5～20 cm土層 LAP、NAG與TN呈顯著正相關(PLAP-TN=0.020,PNAG-TN=2×10?4)。AP與TP呈顯著負相關(PAP-TP=?0.020)。5～20 cm土層土壤酶化學計量比 C∶N 與土壤 N∶P、C∶P 呈顯著負相關 (PSES(C∶N)-N∶P=?2×10?4,PSES(C∶N)-C∶P=?4×10?4)，土壤酶化學計量比 N∶P 與土壤 N∶P、土壤 C∶P 呈顯著正相關 (PSES(N∶P)-N∶P=0.007,PSES(N∶P)-C∶P=0.005)。

表1 不同比例興安落葉松林地土壤(0～5 cm)化學性質Table 1 Soil chemical properties in the depth of 0?5 cm of in different L. gmelinii stands

表2 不同比例興安落葉松林地土壤(5～20 cm)化學性質Table 2 Soil chemical properties in the depth of 0?5 cm of in different L. gmelinii stands

圖4 0～5(A)和5～20 cm(B)土壤酶活性和酶化學計量比與土壤理化因子的冗余分析(RDA)Figure 4 0?5 (A) and 5?20 cm(B) redundancy analysis of soil enzyme activities and ecoenzymatic stoichiometry

3 討論

3.1 興安落葉松所占比例的變化對土壤養分和酶活性的影響

土壤SOC、TN、微生物量、酶活性均隨興安落葉松所占比例的變化而發生改變，這是因為興安落葉松所占比例的變化改變了林分環境，進而影響了凋落物的輸入、土壤微生物量以及土壤理化性質，從而改變土壤酶的活性[28]。植物凋落物作為土壤主要的有機碳源，通過微生物轉化為腐殖質[29]。隨著興安落葉松所占比例的改變，興安落葉松比例為80%、85%的群落SOC質量分數較低而pH較高，這是因為土壤pH的變化與有機質分解過程中產生的H+多少有關[30]，改變了微生物酶活性，進而影響凋落物的分解。有機物中的磷需要在土壤微生物和磷酸酶作用下轉化為無機磷才可被植物吸收利用[31]，但本研究發現：0～5 cm土層AP活性與TP質量分數無關，5～20 cm土層AP酶活性隨TP質量分數增加而降低，且AP活性在5種酶中最高。由于AP酶活性與有效磷呈顯著負相關[32]，說明研究地區土壤可能缺乏有效磷。前人研究表明：當全磷為0.8～1.0 g·kg?1時，土壤可能會出現供磷不足[33]，且由于研究地區土壤呈酸性，磷會形成難溶的磷酸鐵(FePO4)和磷酸鋁(AlPO4), 從而降低有效磷含量[28]。雖然研究地區土壤TP質量分數普遍低于0.8 g·kg?1，但研究地區是否缺磷還需要結合土壤化學計量比進一步探討。

表3 不同比例興安落葉松林地土壤(0～5 cm)酶活性與土壤化學性質間Pearson相關系數Table 3 Peaeson correlation between soil enzymes, ecoenzymate stoichiometry and physicochemical properties in the depth of 0?5 cm of in different L. gmelinii stands

土壤微生物量的多少與土壤養分以及有機質密切相關[34?35]，有機物分解也受到土壤酶活性與土壤微生物量等的影響[36]。在興安落葉松所占比例不同的針闊混交林中，0～5 cm土層SOC、TN、EOOC和AHN質量分數均無顯著變化，0～5 cm土層由于各梯度之間EOOC和AHN無顯著變化，微生物量隨興安落葉松所占比例的改變無顯著變化。5～20 cm土層興安落葉松比例為95%的群落，土壤SOC、TN、EOOC和AHN質量分數達最大值，此時土壤微生物量也達最大值。前人發現：土壤酶活性與土壤微生物和土壤環境密切相關[37]，NAG酶活性隨微生物量增加而增大[38]。本研究發現：在5～20 cm土層土壤微生物量與CBH、NAG、LAP呈顯著正相關，說明在5～20 cm土層，隨落興安葉松所占比例的變化，土壤微生物量與土壤碳氮養分以及土壤微生物量與土壤碳氮酶活性變化具有趨同性。

表4 不同比例興安落葉松林地土壤(5～20 cm)酶活性與土壤化學性質間Pearson相關系數Table 4 Peaeson correlation between soil enzymes, ecoenzymate stoichiometry and physicochemical properties in the depth of 5?20 cm of in different L. gmelinii stands

3.2 興安落葉松林土壤酶化學計量比與土壤理化性質的關系

土壤酶化學計量可以衡量微生物對養分的需求情況[14]。本研究結果表明：5～20 cm土層TN、AHN是影響土壤酶活性的顯著因子，相關性分析也證明了5～20 cm土層土壤酶化學計量比N∶P和土壤酶化學計量比C∶P與TN呈顯著正相關。研究發現：5～20 cm土層土壤酶化學計量比C∶N與土壤酶化學計量比N∶P變化規律相反，表明隨興安落葉松所占比例的變化，氮元素成為土壤微生物的限制因素。相關性分析顯示：0～5 cm土層土壤酶化學計量比與土壤化學計量比均無顯著相關性，表明0～5 cm土層土壤酶化學計量關系比較復雜，與多種因素有關。

本研究區域中，僅有5～20 cm土層土壤酶化學計量比N∶P與土壤N∶P呈顯著正相關，土壤酶化學計量比C∶N與土壤N∶P和土壤C∶P顯著負相關，表明土壤酶化學計量和土壤化學計量比之間存在差異，進一步證實了土壤酶化學計量和土壤化學計量比結果不一致的結論[14]。這是因為土壤化學計量反映的是土壤養分狀況而非微生物可利用養分的狀況，而土壤酶化學計量比既受到土壤微生物和土壤養分元素的影響，還受到有效性碳氮磷的調控[39]。RDA分析也表明：5～20 cm土層土壤酶化學計量比受到TN、AHN的影響，進一步證實了上述觀點。

3.3 興安落葉松林土壤養分限制因子

全球尺度上，土壤 ln(xCBH+xBG)∶ln(xNAG+xLAP)∶ln(xAP) = 1∶1∶1[12](x為酶活性)。興安落葉松比例為95%的群落上下土層土壤酶化學計量比C∶N均小于1，這表明林地受到氮元素的限制。0～5和5～20 cm土層土壤酶化學計量比C∶P、土壤酶化學計量比N∶P均小于1，這表明研究地區普遍缺乏微生物可利用的有效磷。5～20 cm土層興安落葉松比例為95%、70% 時土壤酶化學計量比N∶P顯著高于80%與85%，這表明興安落葉松比例為80%與85%的群落AP酶活性較高，有效磷元素相對缺乏。因為當土壤養分利用率較低時，土壤微生物增加了相應酶的活性，以提高有效氮和有效磷等養分的供應，這與BLOOM等[40]認為微生物會將其資源最優地分配給獲取最有限的資源觀點相一致。

0～5 cm土層興安落葉松比例為70%、80%群落的土壤C∶P大于中國土壤C∶P(136)，土壤N∶P低于中國土壤N∶P(9.3)[41]，這說明興安落葉松比例為70%、80%的群落缺乏磷元素，5～20 cm土層興安落葉松比例為75%、90%、95%的群落土壤N∶P、C∶P高于中國土壤N∶P(9.3)、土壤C∶P(136)[41]，表明興安落葉松比例為75%、90%、95%的群落普遍存在磷元素的限制。

4 結論

在興安落葉松所占比例不同的針闊混交林中5種酶中AP酶活性最高。興安落葉松比例不同的群落所受的限制因子存在差異，0～5 cm土層興安落葉松比例為70%、90%的群落、5～20 cm土層興安落葉松比例為75%、90%、95%的群落受到TP限制。5～20 cm土層興安落葉松比例為80%、85%的群落可能受到土壤有效磷限制。興安落葉松比例為95%的群落上下層均受到土壤有效氮的限制。0～5和5～20 cm土壤酶化學計量比與全球土壤酶化學計量比標準值1∶1∶1有所偏離，0～5 cm土層土壤酸堿度是影響土壤酶化學計量比的關鍵因子，而在5～20 cm土層，則主要受到土壤全氮和有效氮質量分數的影響。由此可見，暖溫帶針闊混交林中興安落葉松所占比例是調控土壤養分動態的一個重要生物因子，而其調控作用的發揮則主要依賴于土壤中酶的活性及其化學計量特征。

5 致謝

感謝內蒙古農業大學張秋良教授、內蒙古大興安嶺森林生態系統國家級野外研究站張廣亮技術員、根河林業局于?？∠壬?，以及張歡、朱雍、曹雨松、郭金粲等同志的幫助。