miR-17-5p和MMP2在百草枯致肺上皮-間質轉化中的機制研究

賈茹珺，李鐵剛

0 引言

近年來，百草枯(Paraquat，PQ)中毒的死亡率居高不下。百草枯可在多種器官內分布，具有明顯的肺毒性，其引起的不可逆的肺纖維化是PQ中毒的主要死因[1]。上皮-間質的轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指在一定的病理生理條件下上皮細胞表型發生改變，轉化為間質細胞的過程[2]。在此過程中，細胞上皮標志物如E-cadherin、緊密連接蛋白-1、細胞角蛋白表達下降[3]，而表達間質的標志物如α-SMA、波形蛋白(Vimentin)、N-鈣黏附蛋白(N-cadherin)等表達上升[4-6]。EMT可參與肺間質纖維化的過程，肺泡Ⅱ型上皮細胞可通過EMT獲得成纖維細胞樣表型，促進膠原沉積及肺纖維化的發生，有研究證實，EMT參與百草枯中毒所致的肺間質纖維化的過程[7-8]。

細胞發生EMT后，其分泌基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)的能力會增強[9]，MMP是調節細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)降解破壞的重要蛋白水解酶，ECM合成和降解失衡會引起細胞外基質積聚，是導致肺間質纖維化的重要病理生理因素，MMP家族的重要成員包括MMP2和MMP9，目前關于MMP2在肺纖維化中的作用研究主要集中于二氧化硅和博來霉素誘導的肺纖維化中[10-12]。有關MMP2在PQ誘導的肺纖維化中的研究極少。在PQ誘導的肺損傷中，MMP9主要參與PQ誘導的急性肺損傷的早期炎癥階段，而MMP2可能主要參與晚期的肺組織損傷修復和纖維化過程[13]，深入研究MMP2在PQ中毒所致的肺EMT過程中的作用具有重要的意義。

近年來，基因芯片和高通量測序等技術的飛速發展徹底改變了研究者對呼吸系統疾病的認識，除了編碼蛋白的mRNA，細胞內還存在大量不能編碼蛋白的RNA即非編碼RNA(Non-protein-coding RNA，ncRNA)。ncRNA分為管家性和具有調控功能的RNA，其中調控型ncRNA包括微小RNA(microRNA，miRNA)和長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)等，miRNA和LncRNA在機體中發揮重要的調控功能，它們可通過調節mRNA的轉錄或翻譯來影響生物反應[14]。

miRNA是長度為22～28 nt的單鏈RNA，由一段具有發夾環狀結構的miRNA前體依次經2個核糖核酸酶Ⅲ內切酶(RNase Ⅲ endonucleases)(Drosha和Dicer)作用后形成，在進化方面具有保守性，其表達具有組織特異性和階段特異性，是影響不同細胞的生理及病理機制的重要元件，可影響靶基因的穩定性并抑制靶基因蛋白水平的表達。在人類基因組中約有1 000個miRNA被鑒定出來，其中約有30%的基因都受其調控[15]。成熟的miRNA與RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結合，再特異性地與靶RNA結合致其降解。miR-17～92 家族包括7種亞型：miR-17-5p、miR-17-3p、miR-20a、miR-19a、miR-19b、miR-92a和miR-18a。miR-17-5p在特發性肺間質纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的肺組織和成纖維細胞中低表達[16]。miR-17-5p可以調控MMP2[17],且經TargetscanHuman 7.2網站(www.targetscan.org/vert_72/)預測miR-17-5p和MMP2之間存在結合位點。目前對miR-17-5p在PQ中毒中的作用僅僅局限于神經毒性的研究，尚無人探討其在PQ致肺EMT中的作用，且MMP2和miR-17-5p在PQ致肺EMT中的作用仍然未知，本研究就此進行分析，為PQ所致肺EMT提供新的潛在診治靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人類肺腺癌肺泡基底上皮細胞A549細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，用含10%胎牛血清(Foetal bovine serum，FBS)的RPMI 1640 (SH30809.01，Hyclone)培養基進行培養，培養環境：37 ℃，5%CO2。

1.2 百草枯染毒 二氯百草枯購買于Sigma-Aldrich (36541，USA)。設置一定范圍的PQ染毒暴露濃度梯度，用無血清的RPMI 1640培養基溶解PQ粉末，配制成高濃度PQ儲備溶液備用。最終加入培養皿中的PQ終濃度依次稀釋為15、30、60 μmol/L，培養6 d，2 d換液1次。

1.3 Western blot 用RIPA中性裂解液(P0013C，江蘇碧云天生物技術有限公司)裂解A549細胞并提取蛋白。經BCA法(北京康為世紀公司)蛋白定量后，取30 μg的蛋白進行SDS-PAGE電泳，恒流轉膜、5%脫脂奶粉封閉后孵育一抗[抗GAPDH抗體(10494-1-AP)購自武漢三鷹生物技術有限公司，抗E-cadherin抗體(ab76055)、抗α-SMA抗體(ab32575)、抗MMP2(ab37150)抗體購自Abcam公司]4 ℃過夜，孵育相應的羊抗鼠(ab97040)或羊抗兔(ab7085)二抗1 h。孵育結束后顯色成像，并用Image J軟件進行條帶灰度分析。

1.4 qRT-PCR 用RNAisoplus (TAKARA，Japan)提取細胞總RNA，取500 ng的RNA進行反轉錄(TAKARA，Japan)，miR-17-5p及U6在進行反轉錄反應時使用廣州銳博生物技術有限公司提供的特異性RT Primer。

反轉錄完成后進行qRT-PCR擴增，miR-17-5p及U6擴增引物購自廣州銳博生物技術有限公司，其余引物由上海生工生物股份有限公司合成。見表1。

1.5 細胞轉染 miR-17-5p的mimic及inhibitor購自廣州銳博生物技術有限公司。將生長狀態良好的細胞均勻接種于60 mm培養皿中，穩定24 h左右，使細胞量達到50%左右；參照銳博生物miRNA產品說明書稀釋mimic或inhibitor及其各自的陰性對照，并制備轉染混合液；將混合液加入到完全無雙抗培養基中并進行加藥處理，37 ℃培養96 h收集細胞檢測。

2 結果

2.1 PQ染毒后E-cadherin、α-SMA及MMP2蛋白表達情況 選取15、30、60 μmol/L 3個濃度PQ溶液對A549細胞進行染毒，培養6 d后，提取細胞蛋白質從蛋白水平檢測染毒細胞E-cadherin、α-SMA及MMP2表達的變化情況。

結果顯示，15 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達與對照組比較差異無統計學意義(t=1.759,P=0.153);30 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達下調(t=3.871，P=0.018)，60 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達下調更明顯(t=4.783，P=0.009)。15 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達與對照組比較差異無統計學意義(t=0.235,P=0.820);30 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達上調(t=2.504，P=0.037)，60 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達上調更明顯(t=3.474，P=0.008)15 μmol/L PQ染毒組MMP2表達與對照組比較差異無統計學意義(t=1.088,P=0.338);30 μmol/L PQ染毒組的MMP2表達上調(t=3.977，P=0.016)，60 μmol/L PQ染毒組MMP2表達上調更明顯(t=5.165，P=0.007)。見圖1。

2.2 PQ染毒后E-cadherin、α-SMA、MMP2 mRNA表達情況 細胞完成染毒后，提取RNA從mRNA水平驗證EMT相關基因及MMP2的表達情況，qRT-PCR結果與Western blot一致。PQ染毒組與對照組相比，15 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達無顯著改變(t=0.620,P=0.569),30 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達下調(t=4.679，P=0.010)，60 μmol/L PQ染毒組E-cadherin表達下調更明顯(t=97.520，P<0.001)；15 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達無顯著改變(t=1.148,P=0.315)，30 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達上調(t=6.481，P=0.003)，60 μmol/L PQ染毒組α-SMA表達上調更明顯(t=24.53，P<0.001)；15 μmol/L PQ染毒組MMP2表達無顯著改變(t=2.659,P=0.057)，30 μmol/L PQ染毒組MMP2表達上調(t=6.004，P=0.004)，60 μmol/L PQ染毒組MMP2表達上調更明顯(t=7.198，P=0.002)。見圖2。

表1 qRT-PCR引物序列

圖1 Western blot檢測PQ染毒后E-cadherin、α-SMA、MMP2表達

2.3 miR-17-5p和MMP2之間結合位點預測 TargetscanHuman 7.2網站(www.targetscan.org/vert_72/)預測miR-17-5p和MMP2的3’端非翻譯區(3-untranslated region，3’UTR)存在兩處結合位點。見圖3。

2.4 miR-17-5p在PQ致細胞EMT模型中的表達情況及其對MMP2的影響 從RNA水平檢測PQ染毒后miR-17-5p相對表達量的變化，與對照組相比，15 μmol/L PQ染毒組miR-17-5p表達無顯著改變(t=0.211,P=0.843)，30 μmol/L PQ染毒組miR-17-5p表達下調(t=4.568，P=0.010)，60 μmol/L PQ染毒組miR-17-5p表達下調更明顯(t=8.325，P=0.001)，說明miR-17-5p在PQ中毒所致EMT的細胞模型中低表達(圖4A)。進一步驗證miR-17-5p與MMP2之間的關系，通過轉染miR-17-5p的mimic(化學合成的成熟miRNA雙鏈)和inhibitor(化學修飾的成熟miRNA互補單鏈)來上調或下調miR-17-5p的表達。通過qRT-PCR驗證mimic和inhibitor的效能及其對MMP2表達的影響，轉染mimic后細胞中miR-17-5p表達明顯上調(t=21.510，P<0.001)，MMP2表達下調(t=7.458，P=0.002)(圖4B)；轉染inhibitor后細胞中miR-17-5p表達下調(t=2.856，P=0.046)，MMP2表達上調(t=5.746，P=0.005)(圖4C)。

圖2 qRT-PCR檢測PQ染毒后E-cadherin、α-SMA、MMP2 mRNA表達

圖4 miR-17-5p在PQ致細胞EMT模型中的表達情況及作用

3 討論

PQ是目前世界范圍內廣泛使用的除草劑，其毒性強、中毒劑量小、預后極差。目前尚無針對PQ的特效解毒藥，PQ中毒機制的研究具有重要的臨床意義。PQ具有明顯的肺毒性，在任何暴露途徑下都主要積聚于肺泡上皮細胞，PQ在肺內的聚積呈時間依賴性增加，會破壞肺組織、引起過度修復及間質組織異常沉積，其導致的不可逆的和廣泛的肺纖維化是PQ中毒的主要死因[18]。EMT常見于腫瘤和纖維化過程，在此過程中，上皮細胞會下調E-cadherin在內的細胞黏附分子的表達，使細胞之間的連接作用減弱甚至消失，而間質表達標志物會上調，增強細胞的遷移能力[19-20]，EMT也可參與肺間質纖維化的過程[21]，肺泡Ⅱ型上皮細胞可通過EMT獲得成纖維細胞樣表型，促進膠原沉積及肺纖維化的發生[22-23]。深入探討EMT在PQ所致肺EMT中的作用機制具有重要臨床意義。

PQ中毒后，肺上皮細胞的EMT可以促進細胞外基質的沉積[23-24]，首先，本研究通過體外細胞實驗檢測PQ中毒后細胞的EMT過程，發現PQ中毒可以引起A549細胞的EMT改變，Western blot和qRT-PCR結果一致提示：一定適宜濃度的PQ染毒后，A549細胞會下調上皮表達標志物E-cadherin的表達，而上調間質標志物α-SMA的表達，驗證了PQ的促EMT作用。

明膠酶MMP2是一種與遷移能力密切相關的蛋白水解酶，可降解基膜的層黏連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白，破壞其完整性。同時這種破壞會進一步加重組織損傷修復，使肺纖維化進行性加重惡化[25]。除了降解基質成分外，MMP2可以調節趨化因子和細胞因子，在炎癥調節過程中可促進遷移到炎癥部位，是和細胞遷移能力增強有關的重要分子[26]。已有研究表明，MMP2的表達異常與肺纖維化密切相關[27]。在肺纖維化的發展過程中，MMP2的異常調節影響疾病的病理過程，MMP2可特異性地裂解ECM的重要成分，如明膠和膠原蛋白，從而破壞肺泡壁的結構[10]。在慢性損傷過程中，MMP可能會破壞肺泡細胞外基質支架，以致破壞正常修復所需的結構模板[28-29]。本研究顯示，在PQ致A549細胞EMT模型中，MMP2表達上調。MMP2在PQ致肺EMT中的作用有待進一步研究。

miRNA是一種具有調節功能的短鏈ncRNA，在動物細胞中大多數的miRNA與其靶基因并不完全互補，miRNA的種子區序列(Seed region)通過和靶基因的3’UTR部分互補，進而阻止其轉錄后的翻譯，起到下調和抑制基因表達的作用[30]。miRNA在肺纖維化的發生發展中具有重要的調控作用[31-33]。miR-17-5p是miR-17～92 家族的成員，在IPF患者肺組織和成纖維細胞中表達下調，可以作用于DNA甲基化相關的分子，在IPF肺成纖維細胞中上調miR-17～92 的表達，可以下調纖維化基因的表達，并使細胞表型正?；痆16]。本研究通過qRT-PCR檢測PQ致A549細胞EMT模型中miR-17-5p的表達情況，研究表明，miR-17-5p在該模型中表達下調。TargetscanHuman 7.2網站(www.targetscan.org/vert_72/)預測miR-17-5p和MMP2存在結合位點，因此，我們進一步通過轉染miR-17-5p的mimic和inhibitor上調或下調miR-17-5p來研究其對MMP2的影響。本研究證實，增加miR-17-5p的表達量可使MMP2的表達下調，相反，降低miR-17-5p的表達量可使MMP2的表達上調，該結果驗證了MMP2是miR-17-5p的下游靶基因，它的表達受到miR-17-5p的抑制。

綜上所述，在PQ致肺上皮細胞EMT模型中，MMP2的表達升高，miR-17-5p表達下調，miR-17-5p和MMP2之間存在結合位點，MMP2的表達受miR-17-5p調控，使其表達受到抑制。本研究初步揭示了PQ致肺上皮細胞EMT中的miR-17-5p和 MMP2之間的相互作用，為PQ致肺EMT的診斷和治療提供新的理論依據，但仍需要進一步的研究加以證實和應用。