雞源乳酸菌的分離鑒定及其生物學特性分析

李宏偉 慈百全 侯明磊 羅智文 張瑤 林連兵 張棋麟

摘要：從健康雞腸道中自行分離篩選出9株乳酸菌株為試驗菌株，通過考察菌種的生長速度、耐酸、耐膽堿、耐腸胃液，并以抑菌性能作為主要指標。通過產酸能力測定、耐酸能力測定、耐受腸胃極端環境性能測定得到2株乳酸菌，2株乳酸菌上清液經牛津杯雙層平板法對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌等5株指示菌株進行抑菌試驗，發現2株乳酸菌對5株指示菌株都具有非常明顯的抑菌作用。采用16s rDNA分子標記對乳酸菌進行鑒定，并構建系統發育樹。經分子生物學鑒定，L2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、L4為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

關鍵詞：雞源乳酸菌;耐受能力;菌株鑒定;抑菌

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0188-04

收稿日期：2019-08-24

基金項目：國家自然科學基金（編號：31760042、31960286）;云南省教育廳科學研究基金（編號：2019J0050）。

作者簡介：李宏偉（1993—），男，內蒙古赤峰人，碩士研究生，主要研究方向為腸道微生物及其高密度發酵。E-mail：lihongwei667@163.com。

通信作者：張棋麟，副教授，研究方向為生態基因組學。E-mail：zhangqilin88888@126.com。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類可以使碳水化合物發酵產生乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱[1];形態上常分為桿狀和球狀2類，為革蘭氏陽性、兼性厭氧型細菌[2];被廣泛應用于發酵食品生產中，被公認為安全的微生物，可應用于醫療、食品添加和畜牧等行業[3-5]。乳酸菌是工業上重要的細菌，這些細菌利用各種底物生產發酵食品和飲料，如牛奶、蔬菜、谷物、肉類、可可豆等。酸奶、奶酪和發酵乳制品被廣泛認為是益生菌的主要來源[6-7]。益生菌被定義為“活的微生物”，在攝入一定數量的益生菌后，除固有的基本營養外，還能發揮健康益處[8-9]。益生菌的有益作用包括預防和治療腹瀉病、預防感染、管理炎癥性腸病、免疫調節等疾病[2，10-11]。本研究從健康雞腸道十二指腸黏膜中分離出優質的乳酸菌，通過對乳酸菌的耐酸、耐膽堿、耐腸胃液能力、產酸能力以及乳酸菌對大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella）等革蘭氏陰性菌及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）等革蘭氏陽性菌抑菌效果等指標測試評價，獲得生長速率快、耐受極端環境強、抑菌作用強、抑菌譜廣的優良菌株。

1材料與方法

1.1試驗地點及時間

本試驗于2019年3—7月在昆明理工大學生命科學與技術學院腸道微生物課題組內完成。

1.2材料與試劑

1.2.1菌種乳酸菌從云南特有品種無量山烏骨雞（Gallus gallus）健康成年雞腸道內分離獲得。沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、無乳鏈球菌為昆明理工大學生命科學與技術學院噬菌體與腸道微生物課題組實驗室保存。

供試雞，購自云南南澗無量山烏骨雞養殖場。

1.2.2培養基與試劑MRS培養基：胰蛋白胨 10.00 g、牛肉粉8.00 g、酵母粉4.00 g、葡萄糖 20.00 g、硫酸錳0.04 g、磷酸氫二鉀2.00 g、檸檬酸氫二銨2.00 g、乙酸鈉5.00 g、硫酸鎂0.20 g、吐溫-80 1.00 g、瓊脂15.00 g，加水至1 L，采用 1 mol/L 鹽酸將培養基pH值調至5.8，121 ℃下滅菌 20 min。

LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉 10 g、瓊脂15 g，加水至1 L，121 ℃下滅菌 20 min。

其他生化試劑：結晶紫、碘液、乙醇、鹽酸、胰蛋白酶、胃蛋白酶、豬膽鹽等所有生化試劑，均購置于上海源葉生物科技有限公司。

1.3主要設備儀器

落地式超凈工作臺[邦西儀器科技（上海）有限公司]、酸堿度pH測定計（上海佑科儀器表有限公司）、紫外分光光度計（上海佑科儀器表有限公司）、立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械有限公司）、臺式高速離心機（四川蜀科儀器有限公司）、恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、恒溫搖床（上海一恒科學儀器有限公司）、電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、超低溫冰箱（日本三洋電器股份有限公司）。

1.4方法

1.4.1雞腸道中乳酸菌的分離和純化取健康雞腸道，采用無菌生理鹽水清洗雞腸道并刮去腸道內容物，在腸黏膜表層不同位置刮取黏液，置于液體MRS培養基中，37 ℃下培養12 h[12]。將菌液取 100 μL 涂布于MRS固體培養基平板上（含5% CaCO3），37 ℃下培養24 h[13]。挑取生長最為旺盛且具有透明溶鈣圈的單菌落繼續在MRS固體培養基上進行分離純化，將產生溶鈣圈的菌落進行革蘭氏染色試驗，革蘭氏染色陽性菌株初步定為乳酸菌，將上述菌株用含有15%甘油的MRS培養基保存于-80 ℃。

1.4.2菌株產酸分析將上述純化后的菌株，取200 μL接種于5 mL MRS培養基中，37 ℃、150 r/min 下培養24 h，使用分光光度計檢測乳酸菌在600 nm處的吸光度，并使用pH計檢測其pH值。

1.4.3強酸耐受性試驗選取產酸能力強的菌株，37 ℃下培養24 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取沉淀，將沉淀重懸于pH值為2.5的MRS液體培養基中，37 ℃、150r/min恒溫培養3h，分別在0、3 h取樣，以稀釋涂布平板法測定菌株濃度[14]。

1.4.4膽鹽耐受性試驗將耐酸菌株接種于含0.3%豬膽鹽的MRS中，37 ℃、150 r/min恒溫培養，于0、4、8 h各取樣1次，采用酶標儀檢測其吸光度D值[15-16]。

1.4.5人工胃腸液耐受性試驗將磷酸鹽緩沖液（PBS）滅菌后，調至pH值為2.5，加入0.3%過濾除菌后的胃蛋白酶，制成模擬人工胃液;將PBS滅菌后，調至pH值為6.8，加入0.1%的胰蛋白酶和0.3%的豬膽鹽，制成模擬人工腸液[16]。

將活化3代的菌液在4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，收集菌體，用上述模擬人工胃液將菌體重新震蕩懸浮，在37 ℃、150 r/min下培養3 h。然后將處理后的乳酸菌按照2%接種量接入至人工腸液中，在37 ℃、150 r/min下培養，分別于0、4、8 h取樣，利用酶標儀檢測其吸光度D值。

1.4.6抑菌試驗將耐酸、耐膽汁的供試菌株接種于MRS液體培養基中培養24 h，離心取上清液，并用0.2 μm的過濾膜除菌，制得供試菌株無細胞培養液。

采用牛津杯法測定供試菌株的抑菌效果，利用牛津杯雙層平板法將5株指示菌株分別混合于上層MRS軟瓊脂培養基中。待凝固后，采用鑷子將無菌牛津杯置于無菌培養皿中，吸取供試菌株無細胞培養液200 μL于牛津杯中，先于4 ℃下放置4～5 h，使培養液完全擴散，在37 ℃下培養24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑[17]，試驗獨立重復3次。

1.4.7數據統計分析每個試驗獨立重復3次，取其平均值并計算標準差。采用Microsoft Excel 2007及IBM SPSS 22.0軟件對數據進行分析作圖。

2乳酸菌菌株的鑒定

2.1乳酸菌基因組總DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取乳酸菌的基因組總DNA。

2.2乳酸菌16S rDNA的PCR擴增、測序與同源性分析

以乳酸菌菌株基因組DNA為模板，利用擴增細菌16S rDNA的通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGATACCTTGTTACGACTT-3′），對乳酸菌的16S rDNA進行PCR擴增。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min;然后 94 ℃ 變性30 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物大小經過瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證后，將目標條帶進行純化，然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行PCR產物的Sanger測序[18-19]。

將乳酸菌序列提交至美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Informmion，NCBI）網站的GenBank數據庫，采用BLAST在線服務器（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將其與細菌數據庫進行比對，通過比對得分最高的已知乳酸菌種類確定種名。

3結果與分析

3.1分離菌株的生長曲線及產酸能力比較

通過含有碳酸鈣的MRS培養基對雞腸道中的乳酸菌進行篩選，經37 ℃恒溫培養箱培養24 h，挑選生長旺盛、溶鈣圈明顯的菌落。將上述菌落繼續在MRS固體培養基平板上進行平板劃線分離，得到純化后具有溶鈣圈的革蘭氏陽性菌疑似乳酸菌9株，對9株疑似乳酸菌菌株編號為L1～L9（表1）。

3.2強酸耐受性比較

選取產酸能力最強的菌株，進行強酸耐受性試驗，得到4株產酸能力強的菌株，于pH值為2.5的強酸MRS培養基中37 ℃恒溫搖床培養3 h，使用稀釋涂布平板法檢測活菌數，見表2。

由表2可知，4株產酸能力比較強的菌株對酸的耐受能力不同，其中L2、L4對酸的耐受能力達到100%，L3耐受力為24.5%，L6耐受力為19%。選擇L2、L4進行下步試驗。

3.3膽鹽耐受性比較

將產酸能力較強的2株乳酸菌L2、L4取 200 μL 接種于5 mL含有0.3%豬膽鹽的MRS液體培養基中，于37 ℃、150 r/min下培養8 h，吸光度檢測結果見表3。由表3可知，2株乳酸菌受0.3%膽鹽脅迫，仍能夠保持良好的生長狀態，L2的膽鹽耐受能力顯著低于L4的耐受力。

3.4乳酸菌抑菌試驗

通過牛津杯平板法對2株乳酸菌進行抑菌能力檢測，由表4可知，2株菌株對5株指示菌株的抑菌圈平均直徑均在18 mm以上，說明2株乳酸菌對以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性菌、以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌都具有非常明顯的抑菌效果。

乳酸菌對致病菌的最低抑菌濃度可以在一定程度上反映金黃色葡萄球菌對乳酸菌的敏感性，也反映了乳酸菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用。抑制濃度越低，乳酸菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用越明顯。由圖1、圖2可知，雖然接種5%乳酸菌無細胞上清液對金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，但效果不明顯。而接種10%以上的乳酸菌無細胞上清液對金黃色葡萄球菌的抑制作用幾乎達到100%。結果表明，一定量的乳酸菌無細胞培養物可以抑制金黃色葡萄球菌的生長。所得數據可為未來工業應用中添加乳酸菌質量濃度的選擇提供直接參考。

3.5耐人工腸胃液比較

由表5可知，2株乳酸菌經人工胃液處理3 h后，活菌數無明顯差異。將2株經人工胃液處理后的乳酸菌轉接至人工腸液中，發現2株乳酸菌均不受人工腸液影響，能夠正常生長，由此推斷2株乳酸菌不但能夠耐受人工胃液，而且能夠在腸液中生長，具備良好的腸胃液耐受能力。

4菌種鑒定

結果表明，菌株L2 16S rDNA基因序列與植物乳桿菌（L. plantarum）均有高于99%的同源性，確定L2菌株為植物乳桿菌。L416SrDNA基因序列

5結論與討論

乳桿菌廣泛應用于發酵食品生產中，如發酵蔬菜、發酵肉類等。本研究從雞十二指腸黏膜上分離得到的2株乳桿菌，較分離于自然環境下的乳桿菌更易于定殖在動物腸道內，維持腸道菌群平衡，經16S rDNA鑒定屬于植物乳桿菌和短乳桿菌。本研究中的2株乳桿菌，產酸、耐酸性能較為突出，均能在pH值=2.5的培養基中生存，這說明2株乳桿菌能夠通過胃達到腸道，這為其發揮益生性能起到了先決作用。2株乳酸菌在含0.3%膽堿培養基中能夠生存并繁殖，滿足了優良益生菌的特性。此外，2株乳桿菌對革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌都具有良好的抑菌效果。由此可知，2株乳酸菌對動物腸道及食品中的有害細菌具有廣譜抑菌作用，這對發酵肉制品、蔬菜等食品生產和貯存具有重要意義。

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