火龍果節律鐘輸出基因HpGI的克隆與表達分析

肖圖艦 馬玉華 袁啟鳳 解璞 毛永亞 嚴佳文 廖仕琴

摘 ?要：節律鐘輸出基因GIGANTEA通過光周期途徑促進植物開花，為研究火龍果GIGANTEA同源基因功能，應用RT-PCR克隆獲得該基因的開放閱讀框序列，命名為Hylocereus polyrhizus GIGANTEA（HpGI），GenBank登錄號為MK609546。序列分析結果表明，HpGI開放閱讀框長度為3537?bp，編碼1178個氨基酸。系統進化分析顯示，HpGI與甜菜BvGI、菠菜SoGI、絲石竹GpGI的分子進化距離較近。預測HpGI定位于細胞核，無信號肽和跨膜螺旋結構域，屬于非分泌蛋白?；虮磉_分析結果表明，HpGI基因在莖和花芽中的表達量顯著高于莖芽、果皮和根;相比對照，延長光周期處理8 d時，其表達量顯著上調。推測HpGI基因可能通過光周期途徑促進火龍果開花。

關鍵詞：火龍果;GIGANTEA同源基因;克隆;表達分析中圖分類號：S59; S813.3??????文獻標識碼：A

Molecular Cloning and Expression Analysis of Rhythms Clock Output GeneHpGI from Hylocereus polyrhizus

XIAO Tujian¹，?MA Yuhua¹， YUAN Qifeng¹， XIE Pu¹， MAO Yongya¹， YAN Jiawen^1*， LIAO Shiqin²

1. Institute of Pomology， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China; 2. Fruit Industry Development Office of Luodian County， Luodian， Guizhou 550100， China

Abstract： Rhythms clock output geneGIGANTEApromotes?flowering via the photoperiod pathway. To analysis the function ofGIGANTEAhomologous gene in pitaya [Hylocereus polyrhizus （Weber） Britton & Rose]， the open reading frame （ORF） sequence was cloned through RT-PCR. The ORF ofHylocereus polyrhizus GIGANTEA（HpGI） is 3537 bp， encoding?1178 amino acids， and the GenBank accession number is MK609546. The phylogenetic analysis showed?that HpGI andBeta vulgarisGIGANTEA are the closest in?molecular evolution distance， followed bySpinacia oleraceaGIGANTEA andGypsophilapaniculateGIGANTEA. It was speculated that HpGI was located in the nucleus， and it was a?non-secretory protein. No signal peptide?and transmembrane helix domain were found.?The results of quantitative RT-PCR revealed that the expression level ofHpGI gene in the stem and flower bud was significantly higher than that in the stem bud， peel and root. Moreover， the transcription of theHpGIgene was significantly induced by the 8?d night-breaking treatment， compared to the untreated samples. It was deduced thatHpGImay promote flowering via the photoperiod pathway in pitaya.

Keywords： Hylocereus polyrhizus;GIGANTEA homologous gene; cloning; gene expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.003

火龍果（Hylocereusspp.）是典型的長日照植物，其中紅肉類型的臨界日照時長為12 h^[1]。在北半球地區，火龍果的自然花期為5—10月^[2]，采用人工補光方式延長光周期可誘導火龍果在非自然產期開花，實現周年生產^[2]。在溫度適宜、植株無花果負載的情況下，持續補光15～45 d即可誘導紅肉類型火龍果的花芽形成和發育^[3-4]，火龍果成花與光照時間密切相關。

植物成花受自身遺傳因子和外界環境因素的共同影響，光周期是主要成花途徑之一^[5-6]。植物節律鐘輸出基因GIGANTEA（GI）是光周期途徑調控開花的關鍵基因之一^[7]，通過應答光周期信號進而調控CONSTANS（CO）和flowering locus T（FT）等開花促進基因^[8-9]。在長日照條件下，擬南芥（Arabidopsis thaliana）GI基因突變體開花時間延遲^[10]，而超表達GI能讓擬南芥提早開花^[11]。長日照單子葉模式植物二穗短柄草（Brachypo-dium distachyon）的GI同源基因表達產物也能促進開花^[12]。應用基因轉化技術將BoGI反義鏈導入甘藍（Brassica oleracea）后，其花期明顯推遲^[13]，說明BoGI行使促進成花功能。GI同源基因在上述長日照植物中具有功能保守性，而在水稻（Oryzasativa）、大豆（Glycine max）和牽?；ǎ?em>Pharbitis?nil）等短日照植物中的作用卻不盡相同。超表達OsGI在長、短日照情況下均導致水稻延遲開花^[14-15];在牽?；ㄖ羞^表達PnGI同樣可以延遲花期^[16]，而大豆GmGI能與FKF1/FKF2蛋白互作而促進開花^[17]。GI及其同源基因的功能在不同日照類型的植物中存在一定的差異。國內外關于火龍果光周期途徑調控成花的研究報道較少，鑒定火龍果GI同源基因并分析其功能具有重要意義。

本研究以自交親和型火龍果新品系黔蜜龍為試驗材料，克隆獲得了GI同源基因編碼區的cDNA序列并進行了結構、系統進化和表達模式分析，以期為進一步研究火龍果GI同源基因功能奠定基礎，為基于延長光周期的火龍果產期調控技術提供理論依據。

1??材料與方法

1.1 材料

以黔蜜龍火龍果[Hylocereuspolyrhizus（Weber）Britton & Rose]為材料，在農業農村部火龍果種質資源保護貴州創新基地（25°21′18′′～?25°21′27′′N，105°46′14′′～105°46′36′′E）進行補光處理，具體參考嚴佳文等^[18]的方法。采集處理1、8、15、21?d和相應對照2年生向陽面結果枝刺座周圍約1?cm²見方的肉質莖，以及自然條件下生長的火龍果根、莖、莖芽、花芽和果皮（花謝后10?d）。所有樣本采集時間均為15：00時左右，3次生物學重復，液氮速凍后保存在?80?℃超低溫冰箱備用。

1.2方法

1.2.1 ?RNA提取及cDNA合成??采用TRIzol試劑提取火龍果總RNA，具體方法參照試劑說明書（Invitrogen，美國）。用NanoDrop 2000檢測總RNA的濃度和純度，Agilent 2100測定RNA完整性。選取RIN值≥7.0、OD_260/280≥1.8、OD_260/230≥1.5的總RNA用于cDNA合成，具體方法參照逆轉錄試劑盒說明書（Promega，M1701，美國）。

1.2.2 ?基因克隆和測序??根據前期獲得的uni-gene序列，應用Primer 5.0軟件設計GI同源基因的擴增引物，引物信息見表1。PCR反應體系為20?μL，包含10×PCR buffer 2.0?μL、10 mmol/L的dNTPs 2?μL、2.5?μmol/L的引物HpGI-F、HpGI-R各2?μL，TaqDNA聚合酶（TaKaRa，RR02MQ，大連）1?U，cDNA 2?μL，去離子水補充體積至20?μL。PCR反應程序為：94?℃預變性4 min;94?℃變性30 s，58?℃復性45 s，72?℃延伸4 min，35次循環;最后72?℃延伸10 min。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并以膠回收試劑盒（Trans-Gen Biotech，北京）進行純化?；厥掌尾捎胮MD18-T克隆試劑盒（TaKaRa，大連）進行TA克隆，隨機選取5個陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，應用NCBI數據庫中的ORF finder程序（https：//www.ncbi.nlm.?nih.gov/orffinder/）預測目的基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）并獲得氨基酸序列。

1.2.3 ?序列分析和系統進化樹的構建??應用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預測蛋白分子量、等電點和疏水性。應用Predict-Protein（https：//www.predictprotein.org/）在線工具進行蛋白質二級結構預測。應用PSORT在線工具（http：//www.psort.hgc.jp/）、TMHMM Serverv.?2.0（http：//www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）和SignalP Serverv.3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/?SignalP-3.0/）分別進行亞細胞定位分析、跨膜螺旋區預測和信號肽預測。應用蛋白質結構域分析程序SMART（http：//www.smart.embl.de/）預測其功能結構域。在NCBI數據庫中下載已報道的其他植物的GI蛋白序列，應用MEGA7.0軟件進行GI蛋白的系統發育分析。采用ClustalW進行多序列比對，設置自展值為1000，以Neighbor Joining法構建系統進化樹。

1.2.4 ?定量RT-PCR分析??根據火龍果HpGI基因序列，應用Primer 5.0軟件設計定量RT-PCR引物，引物信息見表1。應用BIO-RAD CFX?Connect?熒光定量PCR儀分析HpGI的相對表達量。定量RT-PCR反應體系為20??L，具體參照定量PCR試劑盒（Applied Biosystems^? Cat： 4367659）說明書。內參基因引物、定量RT-PCR程序和數據計算、統計方法均參考嚴佳文等^[18]的方法。試驗設置生物學重復、技術重復各3次。

2??結果與分析

2.1HpGI基因克隆

以cDNA為模板，應用引物HpGI-F、HpGI-R擴增GI同源基因序列。凝膠電泳結果顯示，擴增產物大小與預期的3686 bp接近（圖1）。測序得到的堿基序列與前期獲得的unigene序列僅有2個堿基差異，一致性為99.95%。應用ORF finder預測ORF長度為3537 bp，將該GI同源基因序列命名為HpGI，GenBank登錄號為MK609546。

2.2HpGI基因生物信息學分析

2.2.1HpGI編碼蛋白理化性質分析HpGI編碼1178個氨基酸組成的蛋白，分子量為129.196?kDa，等電點6.45，帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）數量為124，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）數量為115，不穩定指數50.69，平均疏水性值為?0.072，屬于親水性蛋白。亞細胞定位和信號肽預測結果顯示，該蛋白定位于細胞核內，沒有信號肽輸出位點，也沒有線粒體靶向肽和葉綠體轉運肽，屬于非分泌蛋白?？缒そY構預測結果顯示，該蛋白無跨膜螺旋區，這一預測結果與其定位于細胞核內相符。

2.2.2HpGI編碼蛋白結構和進化樹分析??將HpGI編碼的氨基酸序列與甜菜（Beta vulgaris）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryzasativa）和玉米（Zea mays）這幾個代表性物種的GI同源蛋白進行序列比對，與BvGI的一致性高達85.41%，與AtGI、OsGI和ZmGI一致性分別為72.51%、69.09%和68.78%（圖2），HpGI與以上4種植物GI蛋白均存在保守的氨基酸殘基（圖2黑色背景部分）。二級結構預測結果表明HpGI的α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲分別占比50.9%、4.8%和44.3%。

為進一步明確HpGI與其他植物GI同源蛋白之間的親緣關系，構建了HpGI與甜菜（Beta vulgaris，Bv）、菠菜（Spinacia oleracea，So）、絲石竹（Gypsophilapaniculata，Gp）、大櫻桃（Prunus avium，Pa）、葡萄（Vitisvinifera，Vv）、桃（Prunus persica，Pp）、甘藍（Brassica oleracea，Bo）、棗（Ziziphus jujuba，Zj）、大豆（Glycine max，Gm）、枇杷（Eriobotryajaponica，Ej）、番薯（Ipomoea batatas，Ib）、番荔枝（Annona squamosa，As）、菊花（Chrysanthemum morifolium，Cm）、黑麥草（Lo-lium perenne，Lp）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）、水稻（Oryzasativa，Os）、玉米（Zea mays，Zm）和苜蓿（Medicago truncatula，Mt）的GI同源蛋白的系統進化樹。結果顯示，18種GI同源蛋白分成雙子葉亞族和單子葉植物亞族，HpGI與擬南芥等同屬于雙子葉植物亞組（圖3）。HpGI與甜菜BvGI（XP 010681268.1）的分子進化距離最近，其次是菠菜SoGI（XP 021849292.1）和絲石竹GpGI（BAW15106.1）。通過系統進化分析，進一步說明HpGI是節律鐘輸出基因GI的同源基因。

2.3HpGI表達分析

應用定量RT-PCR分析了HpGI基因在火龍果不同組織和光照處理材料中的表達情況。HpGI在根、莖、莖芽、花芽和果皮中均表達，其中莖和花芽中的表達量顯著高于莖芽和果皮（P< 0.05），根中的表達量最低（圖4）。光照處理1?d時，HpGI表達量與對照無顯著差異;處理8?d時，

其表達量（11.94±3.26）顯著高于處理1 d（2.20±?0.24）和對照（2.14±0.48）（P<0.05）;處理15和21 d時，其表達量恢復到1 d時的水平，而各對照樣品中的表達量無顯著差異（圖5）。

3討論

GI基因最初從擬南芥中克隆，編碼含有1173個氨基酸的蛋白^[7]。近年來，研究者們從其他植物中克隆到GI同源基因所編碼蛋白大小存在一定的差異。黑麥草LpGI（CAY26028.1）最小，含1148個氨基酸，而棗ZjGI（XP_015886353.1）含有1181個氨基酸。本研究克隆的火龍果GI同源基因開放閱讀框序列為3537 bp，編碼1178個氨基酸，大小與擬南芥AtGI（NP_564180.1）和棗ZjGI更接近。亞細胞定位預測結果表明，火龍果HpGI（MK609546.1）既沒有信號肽輸出位點和跨膜螺旋區，也沒有線粒體靶向肽和葉綠體轉運肽，定位于細胞核，屬于非分泌蛋白，這與菊花^[19]、甘藍型油菜（Brassica napus）^[20]、番荔枝^[21]和番薯^[22]等植物中的研究結果一致。HpGI與其他GI同源蛋白的序列比對結果顯示，HpGI與甜菜BvGI的一致性高達85.41%，與擬南芥、水稻和玉米的GI蛋白一致性分別為72.51%、69.09%和68.78%，且存在多處高保守性的氨基酸殘基。系統進化分析結果表明，HpGI與AtGI、BvGI等同屬于雙子葉植物亞族。以上結果表明，HpGI是節律鐘輸出基因GI的同源基因。

在光周期途徑調控植物開花的過程中，GI基因感受和響應光敏色素和生物節律鐘信號進而調控下游開花相關基因的轉錄水平^[7-9]。HpGI基因在火龍果的根、莖、莖芽、花芽和果皮中均有表達，但在莖、花芽中的表達量顯著高于其他組織，在根中的表達量最低。前人研究表明：甘藍型油菜BnGI在不同組織中表達情況為分生組織>莖>葉>花蕾>果實>根^[20];番荔枝AsGI在葉片、花蕾中的表達量高于頂芽和果實^[21]。HpGI與BnGI、AsGI的表達模式較為一致，這可能是因為葉（莖）和花是感受光周期和響應生物節律信號更為敏感的部位。人工補光處理8 d后，HpGI在火龍果莖中的表達量顯著高于對照和處理1?d時，而對照中的表達量始終無顯著變化。短日照植物菊花暗處理13 d后，CmGI表達量顯著上調^[19]。采用補光措施延長長日照植物的光周期，或者采用遮光措施縮短短日照植物的光周期，均能誘導GI同源基因的表達量上調而促進開花。綜上所述，HpGI基因可能在延長光周期而誘導火龍果成花的過程中發揮作用。

本研究克隆了火龍果GI同源基因，命名為HpGI。通過生物信息學、組織特異性和延長光周期后的基因表達分析，初步研究了該基因表達產物的理化性質、進化關系及其對光周期的響應特征，為進一步闡釋其功能奠定了基礎。后續研究擬將HpGI基因導入擬南芥GI突變體，驗證其功能。此外，通過分析與之互作或受其調控的光周期途徑成花相關基因的表達模式，從分子水平揭示HpGI的作用機制。

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