血吸蟲感染通過抑制前炎癥免疫應答緩解實驗性腦瘧的發生

馮永輝， 曹雅明， 朱曉彤

(1.中國醫科大學附屬第一醫院 檢驗科，遼寧 沈陽 110001; 2.中國醫科大學基礎醫學院 免疫學教研室，遼寧 沈陽 110122)

2017年WHO瘧疾全球報告[1]指出：截至2016年底，全球91個國家和地區約一半人口受到瘧疾威脅，其中2.16億人發病，44.5萬人死亡，死亡人群絕大多數是5歲以下兒童。腦瘧(cerebral malaria, CM)所引起的嚴重神經系統的并發癥是引起5歲以下兒童死亡的主要原因。盡管CM發生的具體機制仍未完全清楚，但瘧原蟲感染的紅細胞在腦部血管內皮細胞之間的沉積是腦瘧發生的主要先前因素；同時宿主免疫應答的失調會進一步加劇腦瘧的發生：過度的前炎癥免疫應答(尤其是Th1型免疫應答)誘導血管內皮細胞黏附分子的表達上調，促進炎性細胞的聚集和紅細胞、血小板的黏附聚集，引起腦組織微血管的堵塞和腦組織缺血，從而誘發中樞神經系統產生一系列癥狀[2]。利用PbANKA感染C57 BL/6小鼠所建立的實驗性腦瘧(experimental cerebral malaria, ECM)模型能模擬腦瘧發生過程中的宿主免疫應答，常用于評價腦瘧的免疫應答水平[3]。在瘧疾流行區，瘧疾患者常常伴隨有蠕蟲感染[4]，但關于混合感染的研究結果存在爭議，主要因為不同研究所采用的小鼠品系、瘧原蟲蟲株，感染途徑不同所致[5]。蠕蟲反復感染常常會改變宿主的免疫應答水平，促使機體產生顯著的Th2免疫應答[6]。Th1和Th2免疫應答的平衡對于瘧疾控制至關重要。而在瘧疾感染過程中，DCs等固有免疫細胞介導的固有免疫應答在平衡Th1和Th2免疫應答的過程中發揮重要作用[7]。因此采用血吸蟲感染模型和ECM模型來探討日本血吸蟲感染對實驗性腦瘧的緩解作用，明確固有免疫應答在此過程中的重要作用，從而為瘧疾流行區蠕蟲混合感染的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及蟲株 3～4周齡，雌性C57 BL/6小鼠，購自中國科學院上海實驗動物中心。日本血吸蟲蟲株(Schistosomajaponicum)購自江蘇血吸蟲病研究所(無錫)，PbANKA由日本愛嬡大學分子寄生蟲學教研室惠贈。

1.1.2 主要試劑 以下抗體均購自BD PharMingen或eBiosciences：抗-CD4-FITC單克隆抗體(GKl.5；BD Pharmingen)、抗-CD25-PE單克隆抗體(PC61；BD Pharmingen)、抗-Foxp3-APC單克隆抗體(clone FJKl6s；eBioscience)、抗FcγIII/II封閉抗體(2.4G2；BD Pharmigen)、抗-CDllc-FITC單克隆抗體(HL3；BD Pharmigen)、抗-CDllb-PE單克隆抗體(M1/70；BD Pharmigen)，抗-CD45R/B220-PerCP單克隆抗體(RA3.682；BDPharmigen)、抗-CD86-PE單克隆抗體(GLl；BD Pharmigen)、抗-MHC II-PE單克隆抗體(M5/115.15.2；BD Pharmigen)、抗-TLR4-PE單克隆抗體(MTS510；BD Pharmigen)、抗-TLR9-PE單克隆抗體(5G5；HBT)、抗-F4/80-FITC單克隆抗體(T45-2342；BD Pharmigen)和抗CD36-PE單克隆抗體(CRF D-2712；BD Pharmigen)。IFN-γ、TNF-α、IL-10細胞因子試劑盒購自R&D公司。

1.1.3 儀器與設備 流式細胞儀(BD FACS Calibuler, USA)，酶標儀(BioRad，USA)。

1.2 方法

1.2.1 實驗模型建立及處理 雌性C57 BL/6小鼠隨機分為4組：正常組(Normal)、感染對照組(Pb)、血吸蟲組(Schistosoma)和混合感染(Schistosoma+Pb)組。Schistosoma組和Schistosoma+Pb組小鼠在感染PbANKA前8周經尾靜脈注射50條血吸蟲尾蚴。然后在第0天，感染對照組和混合感染組小鼠經腹腔分別感染1×106PbANKA寄生紅細胞，建立ECM模型，Normal組小鼠不做任何處理。感染后不同時間，小鼠尾靜脈取血，鏡檢計數紅網織紅細胞數量和細胞感染率，并每日觀察生存率。

1.2.2 脾臟流式細胞術 無菌取出感染后第5天小鼠脾臟，常規方法制備脾細胞懸液[8]，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640調整脾細胞終濃度為1×107/mL。每份樣品用抗-CD11c-FITC單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體、抗-CD45R/B220-PerCP和抗-CD86-APC單克隆抗體進行四色分析，另設陰性對照管。在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 mL，再加入抗-CD11c-FITC單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體、抗-CD45R/B220-PerCP單克隆抗體和抗-CD86-APC單克隆抗體進行表面染色。離心去上清后，用0.5 mL細胞染色緩沖液重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。每份樣品用抗-CD11c-FITC單克隆抗體和抗TLR4-PE單克隆抗體進行雙色分析，另設陰性對照管。每份樣品用抗-CD11c-FITC單抗進行雙色分析, 另設陰性對照管。在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 mL，按試劑說明書所示，進行固定和透膜后，再分別加入生物素標記的抗-TLR9單抗和PE-streptavidin。每份樣品用抗-F4/80-FITC單克隆抗體和抗CD36-PE單克隆抗體進行雙色分析，另設陰性對照管。在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 mL，再加入抗-F4/80-FITC單克隆抗體和抗CD36-PE單克隆抗體進行表面染色。每份樣品用抗-CD4-FITC、抗-CD25-PE和抗-Foxp3-APC單抗進行三色分析，另設陰性對照管。在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1 mL，用抗-CD4-FITC、抗-CD25-PE進行表面染色，固定透膜后，用抗-Foxp3-APC單抗進行胞內染色。采用FACS Calibur流式細胞儀進行檢測，用Flowjo進行分析。

1.2.4 統計學分析 使用SPSS17.0統計軟件對數據進行處理，3組樣本之間采用方差分析比較均值差異，采用Kaplan-Meyer方法進行生存期分析。P< 0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 日本血吸蟲感染對小鼠體重、感染率和生存期的影響

C57小鼠感染血吸蟲1個月后，建立ECM模型。如圖1A與1B所示，在感染后第9天，混合感染組小鼠的原蟲血癥水平顯著低于感染對照組(P<0.05)，隨后2組小鼠的原蟲血癥水平均逐漸上升，最后死于貧血。在第6～11天，70%(7/10)感染對照組小鼠出現腦瘧典型癥狀并死于ECM，并于感染后19 d內全部死亡；混合感染組小鼠30%(3/10)出現腦瘧典型癥狀并死于ECM，所有小鼠于感染后第23天全部死亡，2組生存期存在統計學差異(P<0.05)。同時還監測了2組小鼠的體重變化，圖1C顯示感染對照組小鼠的體重從感染后第7天開始持續下降，在第5天和第9天，混合感染組小鼠的體重顯著高于感染對照組(P<0.05)。

2.2 日本血吸蟲感染抑制ECM模型小鼠脾臟DC的分化和活化

DC分為髓樣樹突狀細胞(mDC)和漿樣樹突狀細胞(pDC)兩種，在抗瘧保護性免疫應答中發揮重要作用，尤其是mDC的數量和功能分子表達水平的高低對ECM的進展至關重要[9]。首先檢測了混合感染對ECM模型DC亞群數量的影響。如圖2A所示，在感染后第5天，血吸蟲感染和/或PbANKA感染能顯著增加DC及其亞群的比例，與感染對照組相比，混合感染組小鼠脾臟中mDCs(CD11c+CD11b+)和pDCs(CD11c+CD45R/B220+)的比例未見顯著差異；但混合感染能顯著降低小鼠脾臟中mDCs和pDCs的數量(如圖2B、2C、2D所示)。此外，還通過FACS檢測了各組小鼠DC的CD86、TLR4和TLR9分子表達水平(如圖2E、2F、2G所示)，結果顯示日本血吸蟲混合感染均能降低PbANKA感染小鼠這三種分子的表達水平，與感染對照組相比，TLR9分子的表達水平顯著降低(P<0.01)。

圖1 日本血吸蟲感染對小鼠體重、感染率和生存期的影響Fig.1 The effect of co-infection on the bodyweight, parasitemia and survival of C57BL/6 mice infected with Pb ANKAA：感染率；B：生存率；C：體重變化;與Pb 相比，*：P<0.05 A: Parasitemia; B: Survival rate; C: Body weight change;* represent P<0.05 compared with Pb group

圖2 日本血吸蟲感染抑制ECM模型小鼠脾臟DC的分化和活化Fig.2 Co-iinfection inhibited the differentiation and activation of DC from the spleen of C57BL/6 mice infected with Pb ANKAA：DC亞群流式結果；B：DC總數；C：髓樣DC總數；D：漿樣DC總數；E：CD86表達水平；F：TLR4表達水平；G：TLR9表達水平;與Pb組相比，*：P< 0.05，**：P< 0.01，***：P< 0.001,下圖同A: FACS results of DC; B: total DCs; C: total myeloid DCs; D: total plasmacytoid DCs; E: MFI of CD86; F: MFI of TLR4; G: DCs expressing TLR9; *， ** and*** represent P< 0.05, P< 0.01 and P< 0.001 compared with Pb group, respectively，same the follow

2.3 日本血吸蟲感染抑制ECM小鼠脾臟巨噬細胞的活化和增殖

2.4 混合感染對ECM前炎癥細胞因子的影響

在小鼠感染后第0、3、5和8天，檢測了Pb組、Schistosoma組和Pb+Schistosoma組脾細胞培養上清中前炎癥細胞因子TNF-α和IFN-γ水平。結果顯示(圖4)，Schistosoma組脾細胞培養上清中TNF-α和IFN-γ的水平在感染后第0～8天未見顯著變化。Pb+Schistosoma組和Pb組脾上清中TNF-α水平在第3天顯著升高，隨后下降(兩組相比，P<0.01)；同時兩組IFN-γ和TNF-α水平在感染后第3天和第5天顯著升高(兩組相比，P<0.01)，隨后下降。

2.5 血吸蟲混合感染對脾臟Treg的影響

Treg作為平衡體內前炎癥免疫應答的一群重要細胞，在調控ECM的進展中發揮重要作用[11]。為此檢測了脾臟中Treg的數量和功能因子IL-10的表達水平。從圖5中可以看出，血吸蟲和/或PbANKA感染會誘導脾細胞中Treg的數量顯著升高(與正常鼠相比，P<0.05)，與Pb組相比，混合感染會增加Treg的數量；血吸蟲感染會顯著提高脾細胞培養上清中的IL-10水平(與正常鼠相比，P<0.05)。

圖3 日本血吸蟲感染抑制ECM小鼠脾臟巨噬細胞的活化和增殖Fig.3 Co-infection inhibited the activation and proliferation of macrophages from the spleen of C57BL/6 mice infected with Pb ANKAA：活化巨噬細胞的流式結果；B：巨噬細胞總數；C：NO分泌水平 A: FACS results of activated macrophages; B: total macrophages; C: secreted NO level

圖4 混合感染對前炎癥細胞因子的影響Fig.4 Effect of co-infection on the pro-inflammatory cytokinesA：TNF-α表達水平；B：IFN-γ表達水平 A: TNF-α levels; B: IFN-γ levels

圖5 日本血吸蟲感染上調ECM小鼠脾臟Treg的數量和功能Fig.5 Co-infection increased the proliferation and function of Treg from the spleen of C57BL/6 mice infected with Pb ANKAA：Treg流式結果；B：Treg總數；C：IL-10表達水平A: Facs results of Treg; B: total Tregs; C: IL-10 levels

3 討 論

瘧疾作為世界三大致死性疾病之一，嚴重威脅居住在熱帶和亞熱帶的居民，其中血吸蟲病與瘧疾混合感染的流行并行尤為常見[12]。目前關于血吸蟲與瘧原蟲混合感染對于宿主免疫應答的文獻報道較少，同時不同種屬的血吸蟲與不同種屬的瘧原蟲混合感染所引起的感染結局不盡相同。有研究認為曼氏血吸蟲與伯氏瘧原蟲混合感染C57BL/6小鼠，對ECM有保護作用[13]；而在Swiss albino小鼠模型中的混合感染會引起原蟲血癥和死亡率顯著升高[14]。目前關于血吸蟲與瘧原蟲混合感染對宿主免疫的影響主要集中于適應性免疫應答，而對于調控Th1/Th2免疫應答至關重要的固有免疫應答的報道較少。為此，本研究通過建立日本血吸蟲與ECM模型來探討混合感染對宿主固有免疫細胞介導的前炎癥免疫應答(包括樹突狀細胞、巨噬細胞數量及其相關功能分子)的影響。結果顯示，日本血吸蟲感染會通過抑制宿主前炎癥免疫應答來緩解實驗性腦瘧的發生。

樹突狀細胞(Dendritic cells, DCs)在誘導Th1免疫應答過程中發揮重要作用，成熟的DCs是活化初始T細胞的重要抗原提呈細胞，能誘導T細胞向Th1/Th2/Treg/Th17等不同的亞群分化。DCs作為固有免疫系統中最重要的細胞亞群，其亞群的分化及功能分子的表達水平會影響后續的Th1/Th2免疫應答形式和強度。DC能直接識別并提呈瘧原蟲抗原給CD4+T細胞，誘導宿主建立抗原特異性的免疫應答[15]。本研究通過FACS檢測了脾臟中兩種重要的DC亞群(mDC和pDC)，結果顯示日本血吸蟲感染會降低兩種DC亞群的數量，尤其是能夠極化Th1免疫應答的mDC數量；CD86作為DC成熟重要標志之一，其表達上調會促進DC的提呈，瘧疾感染過程中，瘧原蟲會通過TLR4和TLR9上調趨化因子和細胞因子的表達，促進宿主的前炎癥應答水平，提示日本血吸蟲感染會降低DC功能分子如CD86、TLR4和TLR9的表達水平，從而抑制DC的成熟和活化。

NO是在病原體感染時主要由iNOS產生，由IFN-γ和TNF-α誘導巨噬細胞產生[16]。NO在CM進展過程中的作用存在爭議[17]。有研究認為感染早期脾細胞培養上清中高水平的NO能夠抵抗瘧疾感染[18]。但也有研究表明NO有助于CM病理發生，體內低水平NO 與CM內皮細胞功能失調和損傷有關[19]：NO水平降低會通過促進內皮細胞活化和白細胞及血小板的沉積來介導血管破壞及降低血流速度。我們檢測了活化巨噬細胞的數量和功能，結果提示血吸蟲感染會抑制PbANKA感染引起的巨噬細胞活化和增殖，從而抑制宿主體內過強的前炎癥免疫應答，從而緩解ECM的發生。

Treg作為體內平衡Th1/Th2免疫應答最重要的免疫細胞，研究發現Treg會通過改變前炎癥免疫應答(IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17和 NO)和抗炎癥免疫應答(IL-10)的平衡來決定ECM的結局[11,20]。血吸蟲感染會增加宿主體內Treg的數量，并抑制體內Th1免疫應答，從而避免過強的免疫應答對宿主腦組織產生損傷。

綜上，前炎癥和抗炎癥免疫應答之間的平衡對于ECM的結局至關重要。本研究表明，日本血吸蟲感染會通過抑制DC亞群尤其是mDC的數量及 TLR9的表達水平來抑制DC的活化，以及巨噬細胞的數量和前炎癥介質如NO和TNF-α等前炎癥免疫應答，以及降低Th1細胞因子IFN-γ的水平，但對Treg的細胞數量未見有顯著影響，猜測是通過血吸蟲感染引起的Th2免疫應答來抑制前炎癥免疫應答，進而緩解ECM的發生，從而延長宿主生存期，也為瘧疾流行區的瘧疾防控提供了參考。