我國不同地區豬源致瀉性大腸桿菌的多重PCR 鑒定及2b-RAD 序列分析

（中國動物衛生與流行病學中心，農業農村部畜禽產品質量安全風險評估實驗室（青島），山東青島 266032）

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是腸桿菌科（Enterobactericaeae）中寄生于恒溫動物消化道下段、兼性厭氧的革蘭氏陰性桿狀細菌，但在特定情況下可致?。阂活愂羌毦纳课话l生改變，成為機會致病菌；另一類是致瀉性大腸桿菌，可引起嬰幼兒與成年人細菌性腹瀉、嘔吐、發熱等。根據毒力因子和發病機制不同，可將致瀉性大腸桿菌分為5 類：產腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC），腸致瀉性大腸桿菌（EnteropathogenicE.coli，EPEC），腸出血性大腸桿菌（EnterohemorrhagicE.coli，EHEC），腸侵襲性大腸桿菌（EnteroinvasiveE.coli，EIEC）和腸聚集性大腸桿菌（EnteroaggregativeE.coli，EAEC）[1]。

在過去的40年內，較為嚴重的致瀉性大腸桿菌感染事件均是通過食物傳播引起的。例如，美國多次暴發的與肉餡有關的O157:H7食物中毒事件，日本1996年暴發的與進食牛肉有關的大腸桿菌疫情，2020年我國貴州省一所學校發生的200 多名學生大腸桿菌食物中毒事件?？梢?，致瀉性大腸桿菌在食源性疾病中扮演著重要角色，目前已成為各國畜禽產品致病微生物監測和控制的重點。豬肉是我國廣大居民最主要的動物源性食品，而生豬屠宰環節是肉品受致病菌污染的關鍵風險點之一。因此，及時監控生豬屠宰環節中致瀉性大腸桿菌污染情況，對控制其傳播、降低食品安全隱患具有重要意義[2]。

為了解我國不同地區生豬肉品中致瀉性大腸桿菌的污染情況及系統進化關系，本研究對近幾年分離自華北、華東、華中及西南4 個地區生豬屠宰環節的283 株大腸桿菌進行了致瀉特性鑒定，并通過2b-RAD 測序，對陽性致瀉菌進行分型分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 近幾年分離自華北、華東、華中及西南4 個地區豬屠體表面拭子的283 株大腸桿菌，其中華北地區60 株、華東地區123 株、華中地區74 株、西南地區26 株，以上菌株均由中國動物衛生與流行病學中心致病微生物監測室分離、鑒定和保存。5 種致瀉性大腸桿菌標準菌株，由中國疾病預防控制中心饋贈。

1.1.2 主要儀器與試劑 冷凍離心機：購自艾本德（上海）國際貿易有限公司；水浴鍋：購自天津泰斯特儀器有限公司；PCR 擴增儀：購自杭州博日科技有限公司；電泳儀：購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；凝膠成像分析系統：購自上海天能科技有限公司。2×TaqMaster Mix：購自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖：購自西班牙Biowest 公司；DL2000 DNA Marker：購自寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯：購自北京陸橋技術股份有限公司；5 種致瀉性大腸桿菌多重PCR 鑒定試劑盒：來自中國動物衛生與流行病學中心致病微生物監測室（生產批次20190917，有效期1年）。

1.2 方法

1.2.1 致瀉性大腸桿菌多重PCR 鑒定 本次檢測的5 種致瀉類型和相應的毒力基因分別為：ETEC-est/elt、EPEC-eae、EHEC-eae+stx、EAECaggR、EIEC-ipaH。采用煮沸法提取283 株待檢菌株的DNA 模板，PCR 反應體系為：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、混合引物1 μL、DNA 模板1 μL、去離子水10.5 μL。引物序列及混合方法參見文獻[3]。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72℃延伸10 min。配制2.5%濃度的瓊脂糖凝膠，取10 μL PCR 產物于加樣孔中，120 V 電泳30 min，在凝膠成像分析儀中觀察電泳結果。

1.2.2 2b-RAD 測序 挑取致瀉性大腸桿菌單菌落接種至2 mL 胰蛋白胨大豆肉湯中，置于37 ℃溫箱中培養18 h；每株陽性菌各吸取200 μL 送至青島歐易生物科技有限公司進行2b-RAD 測序。

1.2.3 序列分析 利用軟件Structure（Verison 2.3.4），對所有測序個體進行種群結構聚類分析；利用軟件Treebest（Version 1.9.2），將獲得的序列構建NJ（Neighbor-Joining）樹，樹的可靠性通過bootstrap 法進行檢驗（重復1 000 次）。

2 結果與分析

2.1 致瀉性大腸桿菌鑒定

5 種致瀉類型和6 種毒力基因的PCR 陽性結果見圖1。本試驗共從283 株大腸桿菌中鑒定出36株致瀉性大腸桿菌，陽性檢出率為12.72%。其中，西南地區最高，為26.92%（7/26），華東地區最低，為10.57%（13/123）。這36 株致瀉性大腸桿菌中，ETEC、EPEC、EAEC 占比較高，分別為33.33%、30.56%、25.00%；而EHEC、EIEC 占比較小，均為5.56%。具體結果見表1。

2.2 種群結構分析

利用軟件Structure（Verison 2.3.4），對所有測序個體進行種群結構聚類。為挑選合適的N（軟件內部稱之為K值），依次設置不同的N值進行多次計算[4]。這里，N值依次選用了3～10 之間的整數，每個N值做3 次重復。根據變化曲線，最終選擇N=8 時的結果作為種群分析結果。分群結果（圖2）顯示，研究群體推斷由8 個亞群組成，即這36 株致瀉性大腸桿菌可分為8 個亞群。

2.3 系統發生進化樹分析

圖1 5 種致瀉類型和6 種毒力基因的PCR 結果

表1 不同地區致瀉性大腸桿菌檢出情況

圖2 36 株致瀉性大腸桿菌的種群結構聚類圖

圖3 36 株致瀉性大腸桿菌的系統發生進化樹

將獲得的序列利用軟件Treebest（Version 1.9.2），構建NJ（Neighbor-Joining）樹，并對樹的可靠性通過bootstrap 法進行檢驗（重復1 000 次）[5]。結果（圖3）顯示：第一，親緣關系較近菌株的致瀉類型基本一致，如1、3、5 均為EAEC，13、14均為ETEC，219、280 均為EPEC；第二，親緣關系較近菌株的分離時間大都比較接近，如1、3、5均分離自2008年，80、141、143、196、207 分離自2010—2012年；第三，來自同一地區菌株的親緣關系相對較近，如49、50、51、52 均來自華北地區，141、143、196、207 均來自西南地區。通過與圖2 比較發現，以上結果與種群聚類結果基本一致。

3 討論

大腸桿菌廣泛存在于自然界和動物腸道。本實驗室近年來評估發現，生豬屠宰環節的大腸桿菌污染，特別是致瀉性大腸桿菌污染，是危害肉品安全的主要風險之一。通過致瀉性大腸桿菌的多重PCR 鑒定及2b-RAD 序列分析，可以更加了解我國不同地區生豬肉品中致瀉性大腸桿菌的污染情況及彼此間的親緣關系，為精準防控生豬屠宰環節致瀉性大腸桿菌污染，保障肉品衛生安全提供了科學數據和技術支撐。

目前，用于鑒定致瀉性大腸桿菌的檢測方法有多種，如動物試驗、血清型鑒定、毒力基因測定等。其中：動物試驗耗時長，如動物選擇不合適或菌株毒力不夠強等，均可導致試驗結果不可信；血清型鑒定費用高、敏感性低，且血清來源和質量以及菌體表面的其他抗原也會影響檢測的準確度[6]；基于不同毒力基因的PCR檢測方法具有簡單高效、準確特異等優點，但單基因PCR 一次只能檢測一種毒力基因或病原，當需要檢測多種基因時就費時費力，成本增加。本試驗采用的多重PCR 檢測方法可高通量測定6 個毒力基因，一次性區別5 種致瀉性大腸桿菌，大大節約了試驗時間和成本，且本方法與單基因PCR 鑒定和血清型鑒定的符合率均為100%[3，7]。

本研究從283 株大腸桿菌中共鑒定出36 株致瀉性大腸桿菌，檢出率為12.72%，其中西南地區檢出率（26.92%）高于其他幾個地區，與張敏等[8]得出的四川省致瀉性大腸桿菌檢出率（29.6%）相似。這可能與當地生豬屠宰場硬件設施配備不足、衛生控制措施執行不嚴、冷鏈設施覆蓋率不高、微生物相關檢測開展不普遍有關。對于致瀉性大腸桿菌檢出率較高的地區，應當特別注意其預防和控制，以有效保障肉品衛生安全。本研究發現，在5 種致瀉類型中，ETEC、EPEC、EAEC 占比較高，表明我國屠宰生豬肉品中污染的致瀉性大腸桿菌以這3種類型為主。

針對病原建立高效準確的追溯技術和分型方法，對于預防和控制病原菌引起相關疾病具有重要的意義。目前常用的大腸桿菌分型方法有表型分型和分子分型兩大類。表型分型成本低、操作簡單，不需要大型儀器設備[9]，因此在基層應用比較廣泛[10]。但其結果容易受培養條件及菌體狀況影響，還需其他方法補充驗證[11]。分子分型方法比較常用的有脈沖場凝膠電泳分型技術（PFGE）、多位點序列分析（MLST）等，但PFGE 在色譜圖上只能反映片段的尺寸和數目，兩個序列不同的片段可能分子量相似，因此可能出現假陽性。此外，如果試驗中使用不同的限制性內切酶，得到的電泳圖譜也會有一定的差異[12]。而MLST 方法運用了高通量測序技術和生物信息學，重復性好、分辨率較高，但不適用于管家基因無變異或變異較低的菌株。2b-RAD 是一種新型的分子分型技術，它利用IIB 型限制性內切酶，通過基因組酶切產生等長的33～36 bp 的酶切標簽。這些標簽經過富集后用于下游的高通量測序反應，通過生物信息學分析實現全基因組范圍高通量SNP 篩查和分型分析[13-14]，保證了每個標記的可靠性和準確性。

本研究檢出的陽性致瀉菌株經2b-RAD 測序、種群結構聚類分析，發現36株菌株可分為8個亞群，同一亞群的菌株親緣關系較近。經系統進化樹分析發現：第一，親緣關系較近菌株的致瀉類型基本一致；第二，親緣關系較近菌株分離時間大都比較接近；第三，來自同一地區菌株的親緣關系相對較近。由此可見，系統進化樹分析結果與種群聚類結果基本一致。但也有例外，這是因為大腸桿菌毒力基因眾多，在漫長的細菌進化過程中，質粒等可移動元件會發生水平轉移[15-16]，其毒力基因也可以重組，使得致瀉類型發生改變。綜上，生豬屠宰環節致瀉性大腸桿菌的流行分布有一定的地域差異，且其親緣關系呈一定的時空特異性。