氮磷形態對銅綠微囊藻的生長影響

周海東，軒玉梅，胡 濤，周姣巖

（上海理工大學 環境與建筑學院，上海 200093）

藍藻通常是富營養化湖泊浮游植物的優勢種［1］，大規模的藍藻水華降低了水資源利用效能，引起嚴重的生態破壞及巨大的經濟損失。目前，藍藻優勢形成的機理已經成為湖沼學研究的熱點問題［2］。氮磷是藻類生長過程中所必需的營養元素［3］，它們在水體中的含量直接影響藻類的生長，從而決定了水華的發生及可能形成的規模和程度，但對于氮磷等營養因子具體需要多少量才導致水華的發生，目前還沒有定論。同時，在氮磷濃度相近的天然水體中，由于污染物來源、環境條件、水交換和動力條件的不同，會導致水體中氮磷形態出現差異。因此，研究不同的氮磷形態和濃度對浮游植物生長、繁殖的影響，對于明確水體中浮游植物優勢種和進一步探討富營養化水體中藻類暴發的機理具有重要意義。

在我國大部分富營養化水體湖泊中，銅綠微囊藻在數量和發生頻率上尤占優勢［4］，本實驗運用光照智能培養箱模擬自然環境，選擇銅綠微囊藻作為實驗藻種，研究了不同氮磷形態對藻類生長的影響，通過對銅綠微囊藻細胞密度及葉綠素a 質量濃度的實時測定來確定藻的生長狀況，研究銅綠微囊藻對氮磷營養鹽的響應，同時為淡水湖泊中藍藻水華的暴發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藻種及接種

實驗所用藍藻為銅綠微囊藻(Microsystems aeruginosa)，購自中國科學院水生生物研究所（武漢）。藻種在實驗前需進行擴大培養，提前培養1～2 周，取適量的待接種藻樣以5 000 r·min-1速度離心15 min 后棄去上清液，向其中加入15 mg·L-1的碳酸氫鈉溶液洗滌后再次離心，重復3～4 次，離心后的藻樣經無菌水稀釋后在無菌條件下接種，初始藻細胞密度約為106個·mL-1。

1.2 實驗方法

培養液的配置以BG11 培養基為基礎，首先以BG11 培養基中的NaNO3和K2HPO4為單一的氮源和磷源，質量濃度設置見表1，研究不用氮磷質量濃度對銅綠微囊藻生長的影響。然后依據NaNO3和K2HPO4對銅綠微囊藻生長影響的最優值研究NH4Cl、NaNO3、NaNO2和K2HPO4、β-G-P、ATP 等不同形態的氮源和磷源對銅綠微囊藻生長的影響。每組實驗設三個平行樣，取平均值。

表 1 氮、磷單因子限制實驗組中的氮、磷質量濃度Tab. 1 N and P concentrations under N or P limited conditions (mg·L-1)

實驗容器選用250 mL 三角燒瓶，向其中各裝入培養基100 mL，用1 mol·L-1的HCl 或NaOH調節pH 為8.0 ± 0.1，放置于光暗比為12 h:12 h、光照強度為2 000 Lux、溫度為25 ℃的光照培養箱中進行培養。為避免光照不均勻，每天手動搖動4～5 次并將錐形瓶互相交換位置。每隔1 d 按時取樣，測定銅綠微囊藻的光密度、葉綠素a 質量濃度及藻密度。

1.3 分析方法

1.3.1 藻細胞密度的確定

取一定量的實驗藻種按一定的稀釋倍數逐級進行稀釋，利用血球計數板將稀釋后的藻樣進行細胞計數，得到相應的藻細胞數目。

1.3.2 葉綠素a 質量濃度的測定方法

取5 mL 實驗液在5 000 r·min-1下離心5 min，棄去上清液，然后加入等體積的體積分數為90%的甲醇溶液混勻，放置在4 ℃黑暗條件下萃取6～8 h，離心取上清液在723N 分光光度計上測定665 nm 處的吸光度，根據式（1）進行計算，即

式中：c為葉綠素a 質量濃度；O665nm為波長為665 nm 時的吸光度。

1.3.3 比增長速率、相對生長常數、平均倍增時間的計算

比增長速率為

式中：μ為比增長速率；Xn、Xn-1分別為計數第n、n-1 天的藻細胞數目；Tn、Tn-1分別為對應于Xn、Xn-1的培養天數。

計算指數生長期內μ的平均值，將其作為該藻種在某一狀況下μ的估計值。

相對生長常數K為

式中：Ot、O0分別為最終、最初的吸光度；t為培養時間。

平均倍增時間G為

2 結果與討論

2.1 氮、磷質量濃度對銅綠微囊藻生長的影響

采用不同質量濃度的NO3--N 和PO43--P 培養基對銅綠微囊藻進行培養，分別測定藻樣中葉綠a 質量濃度、藻細胞密度，以及不同NO3--N質量濃度下銅綠微囊藻比增長速率μ、最大比增長速率μmax、相對生長常數K和平均倍增時間G，結果分別如圖1、2 和表2 所示。圖1（a）中NO3--N 為低濃度時的銅綠微囊藻的藻細胞密度低于中、高濃度時的值；質量濃度為0.2 mg·L-1和0.8 mg·L-1實驗組的銅綠微囊藻在第28 天前，生長趨勢基本相同，但在第34 天后，0.2 mg·L-1實驗組較0.8 mg·L-1實驗組的藻細胞密度要高，說明低濃度仍可以保證銅綠微囊藻的正常生長。1.6 mg·L-1較8.0 mg·L-1的銅綠微囊藻的對數增長期更長。質量濃度為32 mg·L-1明顯比64 mg·L-1培養時生長趨勢更具優勢，但是64 mg·L-1時在第16～24 天出現了停滯期，在第26 天生物量突然增加，說明其進入了第二個對數增長期，并且在兩培養質量濃度下最大藻細胞密度較其余質量濃度下的都要大。從圖1（b）中可知，不同NO3--N 質量濃度在實驗初期（1～8 天）為銅綠微囊藻適應期，葉綠素a 質量濃度無明顯區別。低濃度實驗組中葉綠素a 質量濃度明顯低于中、高濃度實驗組的。質量濃度為4.0 mg·L-1時，葉綠素a 質量濃度同低濃度實驗組的相似，均處于較低水平；質量濃度為8.0 mg·L-1時，葉綠素a 質量濃度在第18 天前并無明顯增加，在第18 天后明顯增加，在第24 天后突然增加，說明其進入了第二個對數增長期。高濃度實驗組中葉綠素a 質量濃度的變化則一直呈現出顯著增長的趨勢，較其他濃度下的都要大。

圖 1 不同氮質量濃度下銅綠微囊藻生長狀況Fig. 1 Growth of Microcystis aeruginosa under different concentrations of nitrogen

由圖2（a）中發現，低濃度PO43--P 實驗組的最大藻細胞密度相同，生長曲線相似。質量濃度為0.5～2.0 mg·L-1實驗組的最大藻細胞密度接近，前期的生長曲線趨勢也相似。質量濃度為1 mg·L-1的實驗組在第12 天前生長極為緩慢，但在第12 天后細胞數量急劇增加。在第14 天前，各濃度下銅綠微囊藻的生長曲線均較為平緩，未出現明顯的快速增長期。但在第14天后，低濃度實驗組均出現對數增長期。隨著細胞數增多，其生長出現了再次的突增，即進行了第二次的對數增長期［5］。由此看出，實驗組均經歷了兩次藍藻暴發，表明低濃度的PO43--P 可以使銅綠微囊藻正常生長，而中濃度比高濃度的PO43--P 更能促進銅綠微囊藻的生長。圖2（b）中表示在不同濃度下的PO43--P 接種4 天后，各實驗組進入不同程度的對數增長期。初期，質量濃度為5.4 mg·L-1實驗組的生長趨勢較緩慢，葉綠素a 質量濃度較低，銅綠微囊藻處于延滯期，但在第20 天后葉綠素a 質量濃度突然增加，進入對數增長期。質量濃度為0.02 mg·L-1時，前期葉綠素a 質量濃度較高，但在第24 天后，其增長趨勢明顯變緩，說明該濃度在后期無法提供足夠的磷源以促進銅綠微囊藻形成葉綠素a；銅綠微囊藻在中、高濃度(0.5～5.4 mg·L-1)時最大葉綠素a 質量濃度比低濃度時高，說明高濃度的PO43--P 更有利于銅綠微囊藻中葉綠素a 的形成。綜合各PO43--P 濃度下葉綠素a 質量濃度的變化，可以得出磷質量濃度為0.2、0.5 mg·L-1時最有利于葉綠素a 的形成，而高濃度(1～5.4 mg·L-1)并不利于葉綠素a 前期的形成［6］，但在后期對葉綠素a 的形成有較強的促進作用。

由表2 中可知，在實驗范圍內，隨著NO3--N質量濃度和PO43--P 質量濃度的增加，比增長速率增大，相對生長常數K 隨著其初始質量濃度的提高而上升；而當NO3--N 質量濃度為 64 mg·L-1時，PO43--P 質量濃度大于 1.0 mg·L-1時，質量濃度的升高對藻類生長無太大的影響，且G 有延伸趨勢。這說明在達到最佳質量濃度前，該藻的增長速率與營養鹽的質量濃度正相關；超過最佳質量濃度水平后，隨著營養鹽質量濃度升高，增長速率將不再升高。從最大比增長速率來看，在NO3--N 質量濃度為0.2 mg·L-1時最大，32 mg·L-1時最小，但其增長速率較為平均，對數期較長，生長較旺盛，說明銅綠微囊藻在低濃度時瞬時增長速率較高，但是對數期后增長速率明顯減小，因此最佳NO3--N 質量濃度為32 mg·L-1。PO43--P質量濃度為0.02 mg·L-1和0.5 mg·L-1時最大比增長速率最大，而質量濃度為5.4 mg·L-1時最小，且質量濃度為0.5 mg·L-1時，其平均增長速率也較大。因此，銅綠微囊藻生長最佳PO43--P 質量濃度為0.5 mg·L-1。

表 2 銅綠微囊藻在不同NO3--N 和PO43--P 質量濃度下的生長情況Tab. 2 Growth of Microcystis aeruginosa underdifferent NO3--N and PO43--P concentrations

圖 2 不同磷質量濃度下銅綠微囊藻生長狀況Fig. 2 Growth of Microcystis aeruginosa under different concentrations of phosphorus

雖然不同的浮游藻類在其生長過程中對營養鹽有各自不同的需求，但在多數湖泊中，浮游藻類的生長狀況與水體中營養鹽濃度變化的趨勢一致；受條件限制，不同實驗組的結果差異很大，一些研究證明水體中營養鹽的增加會導致其中附著藻類的生物量、生產力的顯著增加，而其他的則表明兩者之間的相關性不顯著。營養鹽濃度對熱帶藻類生長影響的研究［7］表明，氮、磷營養鹽濃度的增加對微囊藻的生長均有利，藻類的最大細胞產量均有明顯的增長；磷濃度的增加對三種菌株中MC 藻的暴發和生長具有明顯的促進作用。飼料磷含量高低對水質以及浮游生物組成的影響［8］探究結果顯示，高磷含量（13.5 g·kg-1和8.4 g·kg-1）主要會引發銅綠微囊藻的暴發，而低磷含量（8.7 g·kg-1和11.4 g·kg-1）則主要會引發食用藻類的暴發，這表明磷含量的高低在一定程度上會決定銅綠微囊藻的暴發。Baldia 等［9］研究發現銅綠微囊藻的最佳生長氮磷質量濃度分別是8.71、0.22 mg·L-1；也有研究［10］表明，在BG11培養基中添加高濃度的氮(1 g·L-1NH4Cl)后，銅綠微囊藻的生長被顯著抑制(相關系數P ＜ 0.01)，但同時添加不同質量濃度的磷(0.36～10 mg·L-1KH2PO4)顯著提高了銅綠微囊藻的生長(P ＜ 0.01)，不同磷質量濃度處理之間無極顯著差異，氮磷平衡是影響銅綠微囊藻生長的重要因素。本實驗數據顯示，適合銅綠微囊藻生長的氮磷質量濃度更高。值得注意的是，本實驗和以上實驗中營養元素的質量濃度是有差異的。這種差異表明氮磷質量濃度對藻類生長有共同的影響。有研究表明，水體中營養鹽狀態和浮游生物的光合作用活性之間存在著十分密切的相互作用［11］。由于葉綠素體是微藻進行光合作用的場所，而氮又是組成葉綠體的主要元素，因此，氮的缺乏勢必會影響微藻的光合作用。由于磷元素參與多種物質代謝過程中酶的合成，故可溶性蛋白和碳水化合物的合成可能會受磷所占比例的影響。

2.2 氮磷形態對銅綠微囊藻生長的影響

以上不同質量濃度下NO3--N 和PO43--P 的研究可知，銅綠微囊藻生長的最佳氮質量濃度為32 mg·L-1，磷質量濃度為0.5 mg·L-1；在此質量濃度下研究了NH4Cl、NaNO3、NaNO2三種氮源和K2HPO4、β-G-P、ATP 三種磷源對銅綠微囊藻生長的影響，分別測定藻樣中葉綠素a 質量濃度及藻細胞密度，結果如圖2、3 所示。

圖3（a）表明，在實驗的前6 天三種氮源對于藻細胞密度的增長貢獻極小，在第6 天后，均呈現出明顯的升高，特別是在第10 天后以N 和NO2--N 為氮源培養下的藻細胞密度均呈現快速增長的趨勢，但是NO3--N 氮源相對于N 氮源對于藻細胞密度的增長作用更為持久，并且較NO2--N 和NH4+-N 作為氮源對藻細胞密度的影響較大；而NH4+-N 對藻細胞密度的增長影響最為緩慢，后期藻密度僅為NO3--N 為氮源實驗組的1/2。由圖3（b）中固定質量濃度下氮源對于銅綠微囊藻葉綠素a 質量濃度的影響可知，在實驗的前6 天三種氮源形態對于葉綠素a 質量濃度的變化一致；隨著時間的延長，葉綠素a 質量濃度整體呈現增長趨勢，在前20 天，NO3--N較NO2--N 對銅綠微囊藻中葉綠素a 的增長趨勢較快，但在第20 天后，兩者呈現相反趨勢，表現為經NO2--N 處理的藻體內葉綠素a 質量濃度與經NO3--N 處理的相比要高，約為NH4+-N 實驗組的2 倍；NH4+-N 處理的藻體內葉綠素a 質量濃度則一直以較為平緩的趨勢增長，且一直低于NO3--N 和NO2--N 處理的藻體內葉綠素a 質量濃度，最終達到的質量濃度僅與NO3--N 和NO2--N 實驗組培養到第24 天的持平。由以上分析可知，適于銅綠微囊藻在氮質量濃度為32 mg·L-1情況下生長的最佳氮源為NO3--N，依次為NO2--N 和NH4+-N。

圖 3 不同氮形態下銅綠微囊藻生長狀況Fig. 3 Growth of Microcystis aeruginosa under different nitrogen species

由圖4（a）中發現，在培養期的前12 天，三個實驗組中銅綠微囊藻的藻細胞密度增長趨勢相同且數值相近，第12 天后，三組均出現了明顯的波動增長趨勢；ATP 實驗組在第26 天處于優勢增長狀態，但隨著K2HPO4實驗組在第22 天后的快速增長，最終K2HPO4實驗組在第26 天后藻細胞密度超過ATP 和β-G-P 實驗組，占據了優勢生長狀態；β-G-P 實驗組在第22 天前的藻細胞密度高于K2HPO4實驗組，隨著K2HPO4實驗組在第22 天后的變化，在培養后期β-G-P實驗組的藻細胞密度則一直低于ATP 和K2HPO4實驗組的藻細胞密度。圖4（b）表現出三種磷源對培養的銅綠微囊藻產生的葉綠素a 質量濃度均表現出一個波動增長的過程，且三者的波動增長周期相近；培養前期，K2HPO4和β-G-P 實驗組較ATP 實驗組中銅綠微囊藻對于培養基的適應時間長，分別在第12 天、6 天和4 天后出現明顯的增長趨勢，且ATP 實驗組對于藻內葉綠素a 質量濃度的增長一直處于優勢狀態；在培養24 天后，各實驗組中葉綠素a 質量濃度表現出明顯差異，β-G-P 實驗組較K2HPO4實驗組在后期對于銅綠微囊藻體內葉綠素a 的產生具有優勢?？傮w而言，適于銅綠微囊藻在磷質量濃度為0.5 mg·L-1下生長的最佳磷源為ATP，其次為K2HPO4和 β-G-P。

圖 4 不同磷形態下銅綠微囊藻生長狀況Fig. 4 Growth of Microcystis aeruginosa under different phosphorus species

氮磷是影響水體中浮游植物生長的重要限制因子，由于種屬及質量濃度不同，藻類在對不同形態氮源和磷源的利用程度上也存在差異［12］。王正芳［13］在對藍藻生長的氮磷影響及控制機理研究中發現，水體中總氮、總磷含量并不能作為藻華發生及控制的判別依據，氮磷的存在形態也起著關鍵作用。氮磷的不同形態、不同質量濃度均會對銅綠微囊藻的生長產生不同的影響，每種形態的營養鹽對銅綠微囊藻的最佳生長狀態的質量濃度是有所區別的，適宜藻生長的最佳氮磷形態為NO3--N 和PO43--P。在對不同的氮鹽形態的研究中，多數研究都發現藻類會優先利用NH4CI，當水體中銨鹽質量濃度高于硝酸鹽1～2 μmol·L-1時，銨鹽會抑制浮游植物對硝酸鹽的吸收，且細胞中的硝酸還原酶也會受到抑制［3,14］。也有學者認為，微藻最容易利用的是銨態氮鹽，因為銨鹽可以在谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶的作用下，通過轉氨基作用迅速合成氨基酸，直接被微藻所利用［15］。關于浮游植物對亞硝酸鹽利用的研究一般會結合硝酸鹽被還原的過程，因為在微藻吸收利用硝酸鹽時會進行一系列轉化：硝酸鹽—亞硝酸鹽，亞硝酸鹽—銨鹽，在此過程中微藻會釋放一定量的亞硝酸鹽。陳衛民［16］在研究亞硝酸鹽對銅綠微囊藻生理特性的影響時發現，在亞硝酸鹽單獨存在的條件下，質量濃度小于5 mg·L-1的亞硝酸鹽對銅綠微囊藻的生長沒有明顯影響，隨著培養基中亞硝酸鹽質量濃度逐漸升高到20 mg·L-1，亞硝酸鹽通過抑制銅綠微囊藻的光合作用和升高藻體內氧自由基質量濃度的方式抑制藻的生長。對伊利湖的莫米、桑達斯基海灣以及圣大瑪麗湖［17］中藻類水華的暴發與氮源關系的研究表明，銨離子質量濃度對藍藻水華的暴發影響最大，藍藻的生長速率最快；其次為尿素、氨基酸和丙氨酸對藍藻暴發的影響；硝酸鹽的影響則最弱，藍藻增長速率最低；后期通過穩定同位素15N 的培養研究同樣表明，藍藻在其他氮離子存在的情況下，對于銨離子的吸收利用率最高。

在硝酸鹽存在的條件下硝酸鹽能夠抑制藻對亞硝酸鹽的吸收，并且亞硝酸鹽還會被氧化為硝酸鹽，表明此條件下可以誘導銅綠微囊藻生成亞硝酸氧化還原酶。亞硝酸鹽的吸收實驗顯示在銨鹽存在的條件下，藻對亞硝酸鹽吸收的半飽和常數減少，表明銨鹽能夠刺激藻對亞硝酸鹽的吸收，增加藻細胞內的亞硝酸鹽含量。也有學者認為微藻細胞對硝酸鹽的吸收能力要大于銨鹽，因為在硝酸鹽存在條件下微藻能更好地合成蛋白質。肖華山等以(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3、KNO3、尿素分別作為氮源培養紫球藻(Porphyridium cruentum)，結果發現，NaNO3和KNO3作為氮源有利于微藻合成蛋白質，而銨鹽則不利于蛋白質的合成，并且NaNO3和KNO3缺乏時，細胞會停止蛋白質的合成。此外，王素琴等［18］的研究表明，在正常的培養條件下，與尿素和氯化銨相比，硝酸鉀是促進小球藻(Chlorella)生物合成葉黃素的最佳氮源，小球藻細胞中的葉黃素含量可以達到0.85 mg·g-1。

關于藻類對有機磷的利用可能有兩條途徑：一是直接吸收利用，主要是對于小分子的有機磷；二是對于較大分子有機磷，則需經過如堿性磷酸酶等水解后吸收利用。在對不同磷鹽形態的相關研究中已有實驗表明，微小亞歷山大藻(Alexandrium minutum)、銅綠微囊藻、湛江叉鞭金藻(Dicrateriazhanjiangenis)和小球藻等可以利用磷酸葡萄糖、磷酸甘油和ATP 等作為磷鹽的來源［19-20］，這說明許多浮游植物都能利用有機磷化合物作為營養物質來源。李英等［21］研究東海原甲藻對不同磷源的利用特征時提出東海原甲藻對ATP 和G-6-P 可能是直接吸收，而對G-P可能是第二條利用途徑。除了胞外的磷酸鹽對藻體生長有影響外，胞內磷酸鹽也是影響藻生長的主要因子［22］。

本研究表明，銅綠微囊藻在不同形態的氮磷營養鹽下均能夠持續增長，并且隨著培養時間的延長，培養基內營養鹽質量濃度不斷下降，但是銅綠微囊藻一直呈增長趨勢，說明藻類在適應期后，體內積聚的營養物質有助于藻在后期的持續增長；對于不同形態營養鹽所選取的培養期的質量濃度相同，這也從一方面表現出研究的局限性，即藻類由于在不同形態營養鹽下生長所需的最佳質量濃度存在差異，因此也會對本實驗結果存在一定的影響；此外，由于不同藻類對于生長所需的最佳營養鹽形態以及營養鹽質量濃度等存在差異，因此銅綠微囊藻的生長所需的營養鹽質量濃度和最佳營養鹽形態與其他藻類不同。

3 結 論

通過對氮、磷質量濃度與形態的研究可以發現：

（1）綠微囊藻在不同質量濃度NO3--N 培養下生長的最佳質 量濃度為32 mg·L-1；在質量濃度為32 mg·L-1下，NO3--N、NH4+-N 和NO2--N三種氮鹽中，對于銅綠微囊藻生長最佳氮源為NO3--N，其次為NO2--N 和NH4+-N。

（2）綠微囊藻在不同K2HPO4質量濃度下生長的最佳質 量濃度為0.5 mg·L-1；在質量濃度為0.5 mg·L-1下，ATP、K2HPO4和 β-G-P 三種磷源中，對于銅綠微囊藻生長最佳磷源為ATP，其次為K2HPO4和 β-G-P。