基于高活菌數的百日咳桿菌有效免疫原發酵培養

欒昊 宗朗 喬志 王宇

【摘要】重組百日咳毒素s1亞基基因的質粒在大腸桿菌DH5α和TOP10的兩種菌株中表達，并初步純化了表達產物。從用粗rS1免疫的家兔獲得的血清用于通過HP-PT包被的ELISA測定效價并進行被動免疫保護試驗。在發酵罐中培養百日咳桿菌CS菌株后，通過熱萃取，硫酸銨分級沉淀和離子交換色譜法獲得純化的PRN，并測試了純化的PRN的純度和生物學特性。各種測試表明，純化的PRN的純度超過95%，其相對分子量和等電點與標準PRN一致。隨著pH值繼續上升，PT活性開始下降。 FHA活性和凝血功效顯示出相似的變化，通過測量培養基的pH值以確定何時收獲，可以獲得富含PT和FHA并保持高水平活性的培養基。

【關鍵詞】百日咳桿菌;高活茵數;發酵培養

【中圖分類號】R392-33?【文獻標識碼】B?【文章編號】2096-7225（2020）07-0021-02

引言

百日咳是由革蘭氏陰性細菌百日咳桿菌引起的細菌性呼吸道感染。主要的臨床癥狀是持續數周的咳嗽。這種疾病在嬰兒和幼兒中最嚴重。許多兒童患有嚴重的陣發性咳嗽，導致營養不良，呼吸暫停，肺炎和腦炎，有些兒童死亡。因此，自1980年代以來，包括日本，中國，美國和意大利在內的世界許多國家不斷開發出一種含有百日咳細菌各種活性成分的無細胞百日咳疫苗。研究結果表明，百日咳桿菌特異性細胞免疫的產生與百日咳桿菌對呼吸道感染的抗性獲得有關[1]。在這項研究中，根據發酵24小時后存活細菌的數量，研究了混合發酵的最佳工藝條件，并提供了百日咳桿菌有效免疫原發酵培養的參考數據。

1?材料和方法

1.1菌種

采用百日咳C.SI相菌株。

1.2培養基

采用改良的S-S液體培養基。

1.3發酵液吸光度值的測定

將發酵液用無菌水稀釋（發酵液：無菌水=1：2），混合并離心（5℃，5000g，8分鐘），沉淀用無菌鹽水洗滌1-3次，然后以1：1的比例將細菌重懸在生理鹽水中。使用生理鹽水作為空白對照，在510nm下測量樣品的吸光度，并且使每個樣品為三個平行。

1.4免疫血清制備

使用完全福氏補充劑（家兔1和2）和AI（OH）3通過腹股溝（家兔3和4）使家兔敏感。1周后，將rS1粗品與佐劑（830μg/只）混合以繼續免疫，免疫后6天，福氏不完全佐劑和A1（OH）3 +抗原繼續免疫1000μg/只。兩周后，通過耳靜脈添加了兩次疫苗。第一個為100μg/只，第二個為200μg/只，間隔一周。免疫后3天通過HP-PT-ELISA測定血清滴度[2]。

1.5小鼠免疫保護的特異性試驗

為進一步確定抗血清的特異性，將0.5 mL的GST-PC兔抗血清與50μg天然PRN蛋白均勻混合，并以5 mL恒定體積加入PBS，稀釋5倍，然后在36°C下稀釋5倍35分鐘。發酵后，PRN-ELISA方法測量兩種抗體的水平。之后，腹膜內注射在5只小鼠中培養的血清（0.5mL /小鼠）。以相同的方式治療兔GST-PRN抗血清，并注射4只小鼠。1.5小時后，對所有小鼠進行腹膜內10LD50（4.4x106CFU）HH0809攻擊，觀察1個月內的發病率和死亡，并立即對死小鼠進行尸檢以分離并確認病原體。

2?結果

2.1?細菌生長曲線和pH與溶解氧的動態

延長了培養時間，細菌的濃度逐漸增加。在24小時變化中，細菌濃度為45億/ml，并且在培養48小時結束時確定細菌濁度為280億/ml。同時，隨著延長的培養時間和細菌的生長，細菌液體和溶解氧的pH值也繼續上升。培養開始時，培養液的pH為7.5。40小時后，pH值可達到8.017（圖1）。其中，FHA的活性在培養過程中的變化與PT相似，但FHA活性出現最高峰較PT滯后2-3 h（圖2）。

2.2?血凝滴度的動態

在培養開始時，培養上清液的血凝滴度為1：3，當細菌濃度達到90億/ml時，血凝滴度開始上升。當細菌濃度達到230億/毫升時，在FHA活性最高時，凝血滴度可以達到1：452的最大值，培養基的pH值增加，FHA活性降低，并且凝血滴度也開始下降至1：24（圖3）。

2.3?培養條件與菌形和血清學特異性的關系

從8小時培養開始到48小時結束時采集樣品以測量血清凝集效價，結果均為1：13600，表明菌株在培養過程中保持穩定而沒有相變。取樣染色，革蘭氏染色，奧林巴斯光學顯微鏡，百日咳細菌是典型的球狀桿菌，未發現細菌污染。

3?討論

乳酸桿菌已被證明能夠從人體中清除過量的自由基，并具有抗氧化和抗衰老的作用?？寡趸瘎┲饕敲负推渌x產物，這些產品在乳酸菌細胞內部和外部具有不同的分布[3]，它也與有氧和厭氧生長環境有關[4]。因此，人們試圖使用基因工程方法來增加PT的產量，或進一步開發基因工程百日咳疫苗或亞單位疫苗。研究表明，PRN的不同區域包含一些表位，因此它們都可以具有特定的免疫原性。然而，基于動物免疫保護試驗尚未證實PRN多肽片段的免疫原性。目前，大多數PRN的外部提取均使用基因缺失菌株，例如PT缺失突變W28Aptx，FHA和Agg缺失突變Bp353。我國對PRN的研究利用了全基因的CS菌株，通過共純化硫酸銨沉淀和蔗糖密度梯度離心來純化PRN，同時純化PrI1和FHA保護性抗原。在大規模發酵罐中表達工程菌之前，必須檢查質粒的穩定性，以確保外源基因在宿主細胞中一致且穩定地表達，并且每批的產量和活性均保持一致。

各種測試指標的綜合分析表明，百日咳桿菌的生長和培養pH值，溶解氧，FHA活性和凝血滴度，溶解氧，CO2壓力等檢測指標均發生了變化。dOMP免疫小鼠血清抗體滴度的動態變化表明，單免疫動物的特異性抗體滴度較低，保留時間較短，且抗體類型主要為IgM。同樣，厭氧培養物的抗菌作用遠大于需氧培養物。因此，在細胞分裂過程中隨機產生攜帶這些突變的細胞的可能性非常低，但這些細胞生長迅速，最終取代了正常宿主細胞，并在持續增殖后被培養。另外，免疫血清的保護速率是劑量依賴性的，并且與血清抗體滴度相關，如通過ELSA測量的，表明抗rS1血清具有中和PT毒性的作用。

在有關進行的抗凝集素抗體應答研究表明，在傳統百日咳疫苗接種后，較高的抗體滴度導致較低的抗體應答。實際上，在正常使用過程中產生高水平凝集抗體和低水平抗PT抗體的百日咳細胞疫苗不如產生高水平抗PT抗體的疫苗有效。由于ELSA可以測量特異性反應抗體與PT結合的能力，因此可以推斷出，抗rS1抗血清對小鼠的被動保護能力源于門的結合作用。正在進行研究以評估細胞免疫力和疫苗功效數據之間的關系，但尚未獲得結果，因此無法與血清學研究進行比較。因此，在培養過程中通過取樣確定pH值來確定停止時間更加方便和準確。

自發感染百日咳后，免疫反應不能消除細菌，但是持續感染會導致呼吸道粘膜免疫病理損害。但是，許多實驗表明，免疫可以預防或治療百日咳，這表明在有效接種疫苗后，機體可以誘導出家兔的保護性反應[5]。這表明PRN的C末端蛋白肽保留了PRN的大部分免疫原性。同時，在預防足部感染中阻斷感染機制的關鍵環節表明，可以完全預防口蹄疫。對無細胞百日咳疫苗的免疫反應不取決于免疫前抗體的效價，無論免疫前的抗PT抗體滴度如何，無細胞百日咳疫苗均可誘導高抗PT抗體滴度。尚不清楚無細胞百日咳疫苗的PT免疫原性是否較高，是否還沒有全細胞疫苗的其他成分或尚未發現的其他因素。在存在PRN或PRNF/IM的情況下，FHA不能顯著減輕疾病，但并不表明FHA不是保護性抗原。期望rs1將是百日咳基因工程亞單位疫苗的保護性抗原，并且具有良好的適用性，且在提高rs1的純度之后，免疫保護功能將進一步提高。

綜上所述，百日咳多亞基粘膜佐劑疫苗的免疫保護機制的深入研究可能解決了如何選擇更好的抗原組合和更理想的免疫途徑的問題。此外，更廣泛，科學和嚴格的動物測試結果將為下一次人體實驗打下良好基礎，從而有可能徹底預防和消除百日咳。

參考文獻：

[1] 胡業勤， 段凱， 李新國， et al. 組分無細胞百日咳疫苗純化新工藝的建立[J]. 中國新藥雜志， 2018， 027（021）：2498-2504.

[2] 高晶晶， 李鑫， 喬瑞潔， et al. 百日咳小鼠呼吸道感染模型的建立與應用[J]. 微生物學免疫學進展， 2018， 46（05）：34-41.

[3] 鄧繼巋， 王紅梅， 田樹鳳. 兒童百日咳的臨床特點及實驗室診斷[J]. 中華實用兒科臨床雜志， 2017， 032（022）：P.1692-1695.

[4] None. Incidence and Burden of Pertussis Among Infants Less Than 1 Year of Age： ERRATUM[J]. The Pediatric Infectious Disease Journal， 2017， 36（4）：443.

[5] 鮑永毅，?陳曉，?牛明福， et al. 茵陳內生細菌的分離鑒定與抑菌活性成分分析[J]. 天然產物研究與開發， 2019， 031（011）： 1919-1927.