miR-497-5p靶向調控CCNE1基因抑制胰腺癌細胞增殖

姜達偉，許瀏，王偉林

0 引言

胰腺癌（Pancreatic cancer,PaCa）是惡性程度極高的實體腫瘤，以早期診斷困難、進展迅速、易轉移和化學耐藥性為主要臨床特征[1]。雖然近年來PaCa的治療取得了較大進步，包括手術切除、化療和放療，但PaCa患者術后5年總體生存率仍低于5%[2]。微小RNA（microRNA,miR）是一類長度極短的非編碼RNA分子，通過直接結合靶基因的3'-非翻譯區（3'-untranslated region,3’-UTR）而在轉錄后調節靶基因表達，表現為誘導mRNA降解或抑制mRNA翻譯[3]。有研究表明，miR在PaCa的發生和進展中具有關鍵調控作用[4]。研究發現，miR-497-5p在血管肉瘤中表達下調，并且靶向調控KCa3.1離子通道抑制腫瘤細胞的增殖與侵襲[5]。骨肉瘤組織和細胞中同樣發現miR-497-5p表達下調，且過表達miR-497-5p靶向調控ADP-核糖基化因子樣蛋白2（ADP ribosylation factor-like protein 2,ARL2）抑制腫瘤細胞的增殖并誘導凋亡[6]。此外，Chai等[7]發現miR-497-5p在黑色素瘤組織中表達下調，過表達miR-497-5p抑制A375細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導凋亡。目前，miR-497-5p在PaCa中的作用及其分子機制尚未明確。本研究擬對比進行探討，為該腫瘤的治療提供新的見解及思路。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本收集

收集2008年3月—2013年3月嘉興學院附屬醫院肝膽胰外科通過手術或穿刺方式獲取的34例PaCa癌組織及其相應的癌旁正常組織（癌細胞邊緣≥3 cm），其中男22例，女12例，平均年齡51.72±5.96歲，29例導管腺癌，5例腺鱗癌?；颊咝g前均無放化療記錄。所有組織均由本院兩位病理學專家以雙盲方式進行檢查核對，立即放置于液氮中進行快速冷凍并儲存于-80℃備用。該研究已獲嘉興學院附屬第一醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署書面知情同意書。術后隨訪時間為5年，生存期為手術至死亡時間或手術至最后記錄點時間。

1.2 儀器與試劑

Prism 7900HT/FAST型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國），酶標儀（Thermo Fisher Scientific，美國），FACSCalibur流式細胞儀（Beckman，美國），E-Gel Imager凝膠成像系統（Invitrogen，美國），LSM710倒置光學顯微鏡（Zeiss,德國），熒光素酶測試儀（Invitrogen，美國）。反轉錄試劑（Qiagen，德國），熒光定量試劑盒（Takara，日本），細胞培養基、血清及lipofectamine 2000轉染試劑（Thermo Fisher Scientific，美國），Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（BD，美國），抗CCNE1抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國），miR-497-5p模擬物及模擬物陰性對照（RiboBio，中國廣州），雙熒光素酶報告基因試劑盒（Promega，美國），Capan-2和PANC-1細胞（ATCC，美國）。

1.3 細胞轉染

miR-497-5p模擬物及模擬物陰性對照的序列分別是5’-CAGCAGCACACUGUGGUUUGUAAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3’和5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。將Capan-2和PANC-1細胞接種至6孔板中，細胞融合度約80%后更換無血清培養基。使用lipofectamine 2000進行轉染，分別加入100 pmol miR-497-5p模擬物及模擬物陰性對照，培養6 h后更換含血清培養基，繼續培養48 h后收集細胞并檢測轉染效率。

1.4 CCK-8實驗檢測細胞增殖

將轉染后的Capan-2和PANC-1細胞接種至96孔板中，37℃、5%CO2的條件下分別培養0、12、24、48及72 h，加入20 μl CCK-8溶液，繼續培養 2 h。利用酶標儀在450 nm的波長下檢測每孔光密度值。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期變化

將轉染后的Capan-2和PANC-1細胞接種至6孔板中，37℃、5%CO2的條件下培養48 h后收集細胞，并將細胞密度調至1×106個/毫升。取1 ml單細胞懸浮液放至75%乙醇中4℃固定過夜。冷PBS洗滌細胞三次，37℃恒溫水浴中用RNase A處理細胞30 min，并在4℃暗室中用碘化丙啶染色20 min。流式細胞儀檢測各期細胞比例。

1.6 實時熒光定量PCR實驗

TRIzol試劑抽提細胞和組織的總RNA，并進行反轉錄反應。miR-497-5p反轉錄反應條件：37℃ 60 min，95℃ 5 min及4℃ 30 min。miR-497-5p實時熒光定量PCR反應條件為：95℃ 15 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環。miR-497-5p正義引物：5’-CCTTCAGCAGCACACTGTGG-3’；反義引物：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；以U6為內參，U6正義引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反義引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。CCNE1反轉錄反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s及4℃30 min。CCNE1實時熒光定量PCR反應條件為：98℃ 20 min，98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環。CCNE1正義引物：5’-GGAAGAGGAAGGCAAACGTG-3’；反義引物：5’-GCAATAATCCGAGGCTTGCA-3’；以GAPDH為內參，正義引物：5’-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3’；反義引物：5’-ATGATGTTCTGGAGAGCCCC-3’。采用2-ΔΔCt法計算PaCa細胞和組織中miR-497-5p和CCNE1 mRNA的相對表達水平。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗

采用MiRcode 11（http://www.mircode.org）分析miR-497-5p與CCNE1 3'-UTR之間的結合位點。將人CCNE1 mRNA 3’-UTR（包括miR-497-5p的互補結合位點）克隆至pmirGLO雙熒光素酶報告質粒的螢火蟲基因的下游，構建CCNE1-野生型（WT）報告質粒。同時將突變的結合位點插入螢火蟲基因的下游產生CCNE1-突變體（MUT）報告質粒。將Capan-2和PANC-1細胞接種至6孔板，共轉染0.5 μg CCNE1-WT或CCNE1-MUT報告質粒和50 pmol miR-497-5p模擬物或模擬物陰性對照。轉染48 h后，采用雙熒光素酶報告分析系統檢測螢火蟲和海腎熒光素酶活性，并以海腎熒光素酶活性為參照。

1.8 蛋白質印跡法

采用RIPA裂解液在4℃下提取總蛋白。通過12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膠分離總蛋白，將蛋白質印跡轉移至PVDF膜，37℃、5%脫脂奶粉封閉2 h，膜與抗CCNE1抗體（1:500稀釋）4℃共孵育過夜。TBST緩沖液洗滌3次后，將膜與辣根過氧化物酶綴合（HRP）的二抗（1:2 000稀釋）37℃共孵育1 h。曝光膠片并檢測陽性條帶。

1.9 統計學方法

采用SPSS19.0軟件進行統計學分析。計量資料以平均值±標準差形式表示，計數資料以率的形式表示。采用配對t檢驗分析miR-497-5p與CCNE1 mRNA在癌組織和癌旁組織中的表達差異?？ǚ綑z驗分析miR-497-5p的表達與臨床病理特征的關系。Kaplan-Meier生存分析法分析miR-497-5p的表達與預后的關系。CCK-8實驗結果采用單因素方差分析，其余結果采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-497-5p在PaCa中的表達水平及臨床意義

PCR實驗結果顯示，在癌組織中miR-497-5p表達顯著低于癌旁組織（P<0.001），見圖1A。T3+T4期患者癌組織中miR-497-5p的表達水平顯著低于T1+T2期患者（P<0.001），見圖1B。以miR-497-5p在癌組織表達水平的中位數（0.21）為臨界值，將34例PaCa患者劃分為低表達miR-497-5p組和高表達miR-497-5p組，每組17例。低表達miR-497-5p與較高的T分期相關（P=0.003），而與年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、臨床分級、淋巴結轉移、血管侵犯及CA19-9水平無相關性，見表1。

2.2 miR-497-5p的表達與PaCa患者預后的關系

圖1 實時熒光定量PCR實驗分析miR-497-5p在癌與癌旁正常組織(A)及不同T分期癌組織(B)中的表達Figure 1 miR-497-5p expression in cancer tissues,adjacent normal tissues(A) and different T stages cancer tissues(B)detected by real-time quantitative PCR

表1 miR-497-5p的表達與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關系Table 1 Relation between miR-497-5p expression and clinicopathological characteristics of pancreatic cancer(PaCa) patients

低表達miR-497-5p組與高表達miR-497-5p組的中位生存時間分別為31月和47月。低表達miR-497-5p組中15例患者死亡，2例患者存活，生存率為11.76%（2/17）；高表達miR-497-5p組中12例患者死亡，5例患者存活，生存率為29.41%（5/17）。低表達miR-497-5p組患者5年總體生存率顯著低于高表達miR-497-5p組患者（P=0.036），見圖2。

圖2 Kaplan-Meier法分析miR-497-5p的表達與PaCa患者預后的關系Figure 2 Relation between miR-497-5p expression and prognosis of PaCa patients detected by Kaplan-Meier method

2.3 過表達miR-497-5p對PaCa細胞增殖的影響

與模擬物陰性對照相比，轉染miR-497-5p模擬物可顯著提高Capan-2和PANC-1細胞中miR-497-5p的表達水平（均P<0.001），見圖3A。與模擬物陰性對照組細胞相比，Capan-2和PANC-1細胞轉染miR-497-5p模擬物12、24、48及72 h后細胞的增殖能力顯著降低，見圖3B～C。與模擬物陰性對照相比，Capan-2和PANC-1細胞轉染miR-497-5p模擬物后G0/G1期比例增加，S期比例減少，見圖4。

圖3 miR-497-5p模擬物促進miR-497-5p的表達(A)并抑制Capan-2(B)和PANC-1(C)細胞的增殖Figure 3 miR-497-5p mimics promoted miR-497-5p expression(A) and inhibited proliferation of Capan-2(B) and PANC-1(C) cells

2.4 miR-497-5p對靶基因CCNE1的直接調控作用

生物信息學分析顯示，CCNE1 mRNA 3'-UTR中5’-UGCUGCU-3’序列與miR-497-5p中3’-ACGACGA-5’序列互補結合，見圖5A。CCNE1 mRNA在PaCa癌組織的表達水平顯著高于癌旁正常組織（P<0.001），且癌組織中CCNE1 mRNA與miR-497-5p表達呈負相關（P<0.001），見圖5B～C。與模擬物陰性對照相比，miR-497-5p模擬物顯著抑制CCNE1-WT報告質粒轉染的Capan-2和PANC-1細胞中的相對熒光素酶活性（P<0.001），見圖6A～B。此外，與模擬物陰性對照相比，轉染miR-497-5p模擬物后Capan-2和PANC-1細胞中CCNE1蛋白的表達水平顯著降低（P<0.001），見圖6C。

圖4 miR-497-5p模擬物對Capan-2(A)和PANC-1(B)細胞周期的影響Figure 4 Effect of miR-497-5p mimics on cell cycle of Capan-2(A) and PANC-1(B) cells

圖5 生物信息學分析miR-497-5p對CCNE1的調控作用Figure 5 Effect of miR-497-5P on CCNE1 bioinformatics analysis

圖6 miR-497-5p對CCNE1基因的調控作用分析Figure 6 Analysis of the regulatory effect of miR-497-5p on CCNE1 gene

3 討論

研究表明，miR參與細胞多種病理與生理過程，包括增殖、凋亡、分化、轉移和內分泌穩態等[8]。miR異常表達與人類多種疾病的進展相關，如腫瘤、不育癥、精神性疾病、代謝疾病及高血壓病等[9-10]。目前，研究者已通過高通量芯片在PaCa中篩選出大批差異表達的miR，部分miR作為致癌因子促進PaCa生長與轉移，而另一部分miR作為腫瘤抑制因子降低PaCa生長及轉移[11-12]。例如，Lv等[13]報道miR-661在PaCa中表達上調并促進腫瘤細胞增殖，miR-661可能是PaCa預后相關的一種新的標志物。Ta等[14]證實miR-1290在PaCa中發揮致癌因子作用，miR-1290可能是一種新的PaCa診斷和治療靶標。Zhu等[15]發現miR-101在PaCa中表達下降，過表達miR-101可以抑制腫瘤細胞增殖與侵襲，而干擾miR-101可以降低增殖與侵襲。此外，miR-494通過抑制腫瘤細胞上皮-間質轉化、遷移與侵襲在PaCa中起腫瘤抑制因子的作用[16]。然而，目前仍有很大一部分miR在PaCa中的作用和機制尚不清楚。因此，深入研究這部分miR將進一步闡明PaCa發生發展的分子機制，并將為其治療提供新的靶點。

miR-497-5p定位于人染色體17p13.1區域，屬于miR-15/16/195/424/497超家族成員之一。據報道，miR-497-5p在血管肉瘤、結直腸癌及非小細胞肺癌的發生和發展中起重要調控作用[17]。然而，miR-103在PaCa中的生物學功能仍不清楚。本研究發現，miR-497-5p在PaCa癌組織的表達水平顯著低于癌旁正常組織，這與miR-497-5p在其他腫瘤中的表達特征一致[17]，表明miR-497-5p在PaCa中表達下調。低表達miR-497-5p患者5年總體生存率顯著低于高表達miR-497-5p患者，提示低表達miR-497-5p與PaCa不良預后相關。T3+T4期癌組織中miR-497-5p的表達水平顯著低于T1+T2期癌組織，且低表達miR-497-5p與較高的T分期相關，提示miR-497-5p可能影響PaCa細胞增殖。PaCa進展是腫瘤細胞增殖與轉移的過程，也是腫瘤相關死亡的主要原因。本研究結果證實，過表達miR-497-5p能顯著抑制PaCa細胞增殖，該效應主要通過增加細胞周期中G0/G1期比例，并降低S期比例而實現。該研究結果與miR-497-5p在其他腫瘤中的作用一致[5-7]，表明miR-497-5p具有一定的抗細胞增殖特性。

本研究發現，CCNE1 mRNA 3'-UTR可與miR-497-5p互補結合，提示CCNE1可能是miR-497-5p的靶基因。CCNE1屬于細胞周期蛋白基因家族，具有致癌因子作用，高表達CCNE1與卵巢癌、膀胱癌及乳腺癌預后不良有關[18]。CCNE1可作為CDK激酶的調節劑，與CDK2的調節亞基形成復合物并磷酸化成視網膜細胞瘤基因（RB）轉錄共抑制因子而促進細胞增殖并加速G1/S轉換。CCNE1蛋白在G1/S轉換期積累，隨著細胞進入S期而降解。目前，研究者已在多種腫瘤中觀察到CCNE1基因高表達，且過表達CCNE1導致染色體不穩定并促進腫瘤發生[19]。然而，PaCa中miR-497-5p對CCNE1的調控作用仍不清楚。本研究還發現，CCNE1 mRNA在PaCa癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織，且與miR-497-5p表達呈負相關。過表達miR-497-5p顯著抑制PaCa細胞中CCNE1的蛋白表達水平。此外，miR-497-5p中3’-ACGACGA-5’序列可直接與CCNE1 mRNA 3'-UTR中5’-UGCUGCU-3’序列互補結合而抑制CCNE1蛋白表達。該結果表明，CCNE1是miR-497-5p的靶基因，miR-497-5p通過下調CCNE1基因表達而抑制PaCa增殖。然而，值得注意的是，有報道發現miR-497-5p還可以調控其他靶基因，如信號轉導蛋白SMAD3，ARL2和端粒酶亞單位（hTERT）等[9-11]。miR-497-5p是否也通過下調這些靶基因而抑制PaCa細胞的增殖有待進一步研究。

綜上所述，miR-497-5p在PaCa中表達下調，低表達miR-497-5p與較高的T分期及不良預后相關。過表達miR-497-5p通過改變細胞周期而抑制PaCa細胞增殖。CCNE1是miR-497-5p的靶基因，miR-497-5p靶向調控CCNE1基因表達抑制胰腺癌細胞的增殖。miR-497-5p可能是一種新的PaCa治療靶標。