長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在肝癌組織中的表達及臨床意義

0 引言

肝癌為臨床高發惡性腫瘤，其發病率及死亡率逐年升高，由于患者早期癥狀不明顯，多數患者就診時處于中晚期，往往錯過根治性手術最佳時機[1-2]。盡管肝癌的臨床診療手段日趨成熟，但患者術后五年生存率仍較低[3]。因此，尋找肝癌生物學標志物對患者的早期診療及預后評估具有重要意義。長鏈非編碼RNA是近年來發現的一類可參與腫瘤細胞增殖、遷移和凋亡等多個層面調控的不編碼蛋白質的RNA[4]。本研究組前期通過芯片技術發現，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達量隨肝癌的發生發展進程變化明顯，因此，我們采用實時定量反轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）進一步驗證其在肝癌組織中的表達，并分析了其與患者臨床病理特征及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月—2018年10月中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院收治的106例原發性肝癌患者，均經手術病理證實為肝細胞癌，且術前均未接受化學藥物及放射治療。其中，男57例，女49例；年齡38～73歲，平均年齡57.42±3.69歲；按AJCC第八版分期標準分為：Ⅰ期23例，Ⅱ期55例，Ⅲ期17例，Ⅳ期11例；淋巴結轉移11例；腫瘤直徑1.2～9.7 cm；乙型肝炎73例（判定標準：患者血液標本中可檢測到乙肝病毒DNA）。本研究經醫院倫理學委員會審批通過，入組對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 組織樣本 術中切取肝癌及癌旁正常組織（距腫瘤組織邊緣≥2 cm，經病理證實無癌細胞）作為檢測樣本，置于-80℃的冰箱中保存待檢。

1.2.2 試劑與儀器 TRIzol 試劑購于美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒均購于美國ABI公司，7500型qRT-PCR儀及Veriti 96孔熱循環儀購于美國ABI公司，分光光度計購于美國Bio-Rad公司。

1.2.3 總RNA提取 取4 mm3樣本組織超聲勻漿，按照TRIzol試劑盒說明書提取樣本中總RNA，經DEPC水溶解，應用分光光度計測定RNA的濃度和純度。另取1 μl RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，將電泳條帶清晰者用于qRT-PCR檢測。

1.2.4 反轉錄反應 按照反轉錄試劑盒說明書操作，采用熱循環儀將長鏈非編碼RNA HOXA11-AS反轉錄為cDNA，反應體系為20 μl：RNA樣品2 μl、引物1 μl、5×RT buffer 4 μl、dNTP Mixture（10 mmol/L）1 μl、U6 Reverse primer 1 μl、Reverse Transcriptase 1 μl、RNase Inhibitor 0.5 μl、RNase Free H2O 9.5 μl。反應條件：65℃ 5 min，37℃ 2 min，5℃ 5 min，37℃ 10 min，65℃ 10 min。

1.2.5 實時定量反轉錄聚合酶鏈反應q RTPCR 應用Primer premier 6.0軟件設計引物，并委托上海生工生物工程有限公司進行合成。長鏈非編碼RNA HOXA11-AS：上游引物序列為：5’-GCCACAUGCACCCGCCUCAGUGGUUCACA AUGGCAUCCGCUGAA-3’，下游引物序列為：5’-CAUCAGACACAGUCCACUAUGCG-3’；內參U6引物序列為：5’-CTCGTGCAGCACAGCTC-3’（正義），5’-AGCTACAACGTATCTGTCTG-3’（反義）；長鏈非編碼RNA HOXA11-AS反轉錄引物序列為：5’-UCGUGAUCUGUCACUUCAAG CGAGAGAGCACUUAUGGCCCGCAUGCAGUG CAA-3’；內參U6反轉錄引物序列為：5’-AATCTG GTATCCGTGCCTCTAGT-3’。按照qRT-PCR試劑盒說明書操作，采用7500型qRT-PCR儀進行實時熒光定量PCR，反應體系為25 μl：已稀釋的cDNA 2 μl、引物2 μl、SYBR 12.5 μl、ddH2O 8.5 μl。反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt方法計算長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的相對表達量，以U6為內參，?Ct=Ct長鏈非編碼RNAHOXA11-AS-CtU6。

1.3 術后隨訪

隨訪截至2019 年10 月，平均隨訪時間為（25.42±2.61）月，無失訪病例。隨訪方式主要為門診隨訪和電話隨訪，術后第一年每3月隨訪一次，第二年開始每半年隨訪一次，隨訪期內出現復發和（或）轉移為病情惡化，患者死亡為隨訪終止事件。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在肝癌及癌旁正常組織中的表達

檢測結果顯示，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織（2.97±0.81vs.0.83±0.22,t=26.249,P<0.001），見圖1。

圖1 長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在組織樣本中的相對表達量Figure 1 Relative expression of lncRNA HOXA11-AS in tissue samples

2.2 肝癌組織中長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達與臨床病理特征的關系

長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在不同AJCC分期及是否發生淋巴結轉移的肝癌組織中的表達量比較差異有統計學意義（P<0.001），見表1。

表1 長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達與肝癌患者臨床病理特征的關系 ()Table 1 Relation between lncRNA HOXA11-AS expression and clinicopathological characteristics of liver cancer patients ()

表1 長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達與肝癌患者臨床病理特征的關系 ()Table 1 Relation between lncRNA HOXA11-AS expression and clinicopathological characteristics of liver cancer patients ()

2.3 生存分析

隨訪期內，106例原發性肝癌患者中51例患者病情發生惡化，其中，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS高表達（≥2.97）36例，低表達（<2.97）15例。Kaplan-Meier分析結果提示，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS高表達組1年、2年、3年生存率均明顯低于低表達組（1年：39.72%vs.62.71%,χ2=11.715,P<0.001; 2年：30.56%vs.53.33%,χ2=6.029,P<0.001; 3年：22.22%vs.53.33%,χ2=4.760,P=0.029），見圖2。為進一步探究長鏈非編碼RNA HOXA11-AS是否為預測原發性肝癌患者預后的獨立危險因素，我們進行了單因素和多因素Cox回歸分析，結果提示，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS高表達、AJCC分期增高是影響原發性肝癌患者預后的獨立危險因素（95%CI:1.315～4.083/0.876～3.845,P=0.017/0.022）。

圖2 長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達與肝癌患者生存期的關系Figure 2 Relation between lncRNA HOXA11-AS expression and survival of liver cancer patients

3 討論

肝癌為常見的惡性腫瘤，臨床死亡率較高，由于早期癥狀較為隱匿，臨床檢出率較低[5]。因此，尋找肝癌早期診斷標志物成為臨床關注的焦點。長鏈非編碼RNA為不編碼蛋白質的RNA，在發現初期并未獲得足夠重視，隨著臨床研究的深入，有研究發現長鏈非編碼RNA可在表觀遺傳學、基因組轉錄及轉錄后等層面上調控基因的表達[6]。最近有研究顯示，長鏈非編碼RNA在腫瘤細胞增殖、遷移、凋亡等過程中發揮調控作用[7-8]。盡管目前在肝癌組織中發現了多種長鏈非編碼RNA，但臨床對于長鏈非編碼RNA與肝癌的關系尚不明確。本研究組前期通過芯片技術發現，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達量隨肝癌的發生發展進程變化明顯。因此，我們猜想長鏈非編碼RNA HOXA11-AS有可能成為臨床肝癌診療的新靶點。

本研究發現，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在肝癌組織中高表達，且在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織。通過分析長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達與肝癌患者臨床病理特征，發現其在不同AJCC分期及是否發生淋巴結轉移的肝癌組織中的表達量間差異有統計學意義，結果提示，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達與肝癌的發生及轉移有關，其可能在肝癌中發揮促癌作用。張莉等[9]對24例頭頸部鱗狀細胞癌患者進行研究，發現長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在頭頸部鱗狀細胞癌組織中表達上調，可促進癌細胞的遷移，可能成為頭頸部鱗狀細胞癌治療的新靶點。張鴻程等[10]對13例骨肉瘤患者研究發現，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在骨肉瘤細胞表達下調，且長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的過表達可抑制骨肉瘤的發生發展，可能成為骨肉瘤治療潛在的分子靶標。由此可見，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在惡性腫瘤組織中表達異常，但其表達量在不同腫瘤中存在差異，推測這可能與腫瘤的異質性有關[11]。

本研究進一步分析了長鏈非編碼RNA HOXA11-AS與肝癌患者預后的關系，發現長鏈非編碼RNA HOXA11-AS高表達組3年生存率明顯低于低表達組，結果提示，其高表達可能與肝癌患者預后不良有關。進一步采用單因素和多因素Cox分析發現，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS高表達、AJCC分期增高是影響原發性肝癌患者預后的獨立危險因素，提示長鏈非編碼RNA HOXA11-AS可作為肝癌患者預后的評價指標。

綜上，肝癌組織中長鏈非編碼RNA HOXA11-AS表達上調，其可能參與肝癌的發生發展，可成為肝癌患者預后評估的新指標。