博來霉素誘導的小鼠肺纖維化組織中組蛋白3和組蛋白4乙?；兓?/h1>
2020-09-16 06:33李明瑋張永鋒
山西醫科大學學報 2020年8期
李明瑋,張永鋒,霍 靜
(1首都醫科大學附屬復興醫院風濕免疫科,北京 100038;2首都醫科大學附屬北京朝陽醫院風濕免疫科;*通訊作者,E-mail:dr-limingwei@126.com)
肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是多種慢性肺臟疾病常見的終末病理表現,也是慢性肺臟疾病死亡的主要原因。肺纖維化的發病機制仍不十分清楚,目前假說有損傷、炎癥、修復障礙及各種原因導致的肺泡損傷(如氧化應激)等。但是,上述因素均不能完全闡明其發病機制。近10年,涉及組蛋白(histone)乙?；?去乙?；c臟器纖維化的研究逐漸進入人們的視線。臟器纖維化動物模型及臨床試驗均表明,組蛋白乙?；桥K器保護機制[1-3]。肺纖維化初步研究證實,體外培養的肺纖維化患者肺成纖維細胞,組蛋白乙?；较陆礫4]。因而,為深入探討肺纖維化發病機制提供了全新的理念。
本研究擬通過博來霉素氣管給藥建立模擬肺纖維化的小鼠模型,在病程進展過程中,動態監測肺組織炎癥/纖維化程度及組蛋白3和組蛋白4乙?；?以明確肺纖維化過程中組蛋白3和組蛋白4乙?；诜谓M織炎癥/纖維化過程中的變化情況,為探明肺纖維化潛在的機制變化,及后續靶點的尋找提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
博來霉素A2(日本化藥株式會社,日本),Masson染色試劑盒(索萊寶生物科技有限公司),蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)，總組蛋白3抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國)，總組蛋白4抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國)，乙?；M蛋白3抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國)和乙?；M蛋白4抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國)，PCNA抗體(碧云天生物技術有限公司),TBS溶液(索萊寶生物科技有限公司)。
1.2 肺纖維化的小鼠模型建立
6-7周齡雄性C57BL/6J小鼠,SPF級,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號:SCXK(京)2012-0001),飼養于首都醫科大學動物部(許可證號:SCXK(京)2015-0012)清潔級動物房。所有動物實驗經首都醫科大學動物實驗及實驗動物福利委員倫理審查通過(倫理編號:AEEI-2016-005)。獨立通氣籠盒(individual ventilated cages,IVC)系統,飼養密度<5只/籠,12 h光照/12 h黑暗,室溫21-22 ℃,相對濕度50%-70%,自由飲水、攝食。
6-7周齡雄性C57BL/6J小鼠48只,隨機分為博來霉素組、鹽水組和正常對照組。腹腔注射10%水合氯醛(3.5 μl/g體質量)麻醉小鼠,單次氣管內給藥,博來霉素組給予博來霉素A2生理鹽水溶液2.5 μl/g體質量(相當于5 mg/kg體質量)[5],鹽水組給予生理鹽水溶液2.5 μl/g體質量。自由喂養。于氣管給藥后第7,14,21天,各組隨機選取動物依次處死、取肺。
1.3 組織學檢查
將10%甲醛緩慢注入新鮮肺組織,至肺充盈漲大(內固定),迅速置于10%甲醛固定不低于24 h。將肺組織包埋在石蠟中,制備切片(4 μm),分別進行HE染色和Masson三色染色。
采用肺泡炎分級評分[5]評估HE染色肺泡炎癥。100倍視野下,選取所有視野進行評分,視野選取應避開大氣管與大血管,取所有視野評分值的均數作為該樣本炎癥評分,采用盲評方法。
Masson染色肺組織用于纖維化分級評分[6]。100倍顯微鏡下,拍攝所有視野照片,每個視野隨機放大40倍顯微照片一張,放大視野選取避開大氣管與大血管,取所放大照片評分值的均數作為該樣本纖維化分級評分,采用盲評方法。
1.4 組蛋白3、4乙?；蕶z測
Western blot檢測總組蛋白3(1 ∶1 000稀釋,CST,#9715),總組蛋白4(1 ∶500稀釋,CST,#2592),乙?；M蛋白3(1 ∶1 000稀釋,CST,#9649)和乙?；M蛋白4(1 ∶500稀釋,CST,#13534)的表達,以PCNA(1 ∶1 000稀釋,碧云天,AF0261)作為內部參照,使目標蛋白表達標準化。使用SDS-PAGE(分離膠12%,積層膠5%)分離變性核蛋白樣品(100 ℃,5 min;每個泳道50 μg)。通過電轉印跡將蛋白轉移到PVDF膜上。室溫用含有5%脫脂奶粉的TBS溶液封閉2 h。在4 ℃下,一級抗體孵育過夜。加二級抗體是熒光羊抗兔IgG(1 ∶10 000)或熒光羊抗鼠IgG(1 ∶10 000),室溫孵育2 h。使用Odyssey LI-COR SA雙色紅外激光成像系統掃描成像,分析蛋白條帶。組蛋白乙?；?乙?；M蛋白/總組蛋白。
1.5 統計學分析
2 結果
2.1 實驗小鼠一般情況
小鼠造模后飼養過程中,存在自然死亡,博來霉素組死亡8只、鹽水組死亡2只、空白對照組死亡0只。博來霉素組4只小鼠發生下肢運動障礙,均伴有下肢皮膚紫紺、脫毛、肌肉萎縮、皮溫厥冷。
2.2 肺泡炎評分
通過對小鼠肺組織進行HE染色觀察各組肺泡炎情況,結果發現,肺泡炎癥博來霉素組明顯重于鹽水組,博來霉素組廣泛肺泡結構破壞,肺泡間隔明顯增厚,實質區明顯增多,肺泡內及間質炎性細胞浸潤,給藥后7 d病變呈局灶性,給藥后14 d呈彌漫性>20%肺組織,嚴重時>50%肺組織,伴有出血(紅色箭頭),肺大泡(向左箭頭),甚至官腔閉合(三角箭頭),給藥后21 d時肺組織病變更重(見圖1)。博來霉素組在氣管給藥后7,14,21 d時肺泡炎評分均顯著高于鹽水組(見表1)。博來霉素組肺泡炎評分峰值出現在第14天,第7天與第14天差異顯著。說明博來霉素氣管給藥,誘導肺泡炎,持續進展,給藥后第14天達到高峰,隨后趨于平穩,逐漸下降。
圖1 小鼠肺組織病理HE染色鏡下表現 (×400)Figure 1 HE staining of pulmonary tissues in mice (×400)
表1 各組肺泡炎評分比較
2.3 肺纖維化評分
通過對小鼠肺組織進行Masson染色觀察各組肺纖維化情況,結果顯示,博來霉素組肺纖維化明顯重于鹽水組,博來霉素組肺組織結構紊亂,肺泡間隔廣泛增厚明顯(隔厚度≥3X正常),部分間質纖維化毗連呈墻,甚至條塊狀膠原纖維沉積于肺間質(紅色箭頭),嚴重時肺泡腔被膠原纖維填滿(實三角形),肺泡間隔消失,正常肺泡結構不能保留,膠原纖維條塊連結成片(>顯微鏡視野50%)(見圖2)。博來霉素組在氣管給藥后7,14,21 d肺纖維化評分均顯著高于鹽水組(見表2)。博來霉素組肺纖維化評分進行性升高,峰值出現在第21天。說明博來霉素氣管給藥后,纖維化持續進展,給藥后7-14 d變化急劇,14-21 d變化趨于平穩。
表2 各組肺纖維化評分比較
圖2 小鼠肺組織病理Masson染色鏡下表現 (×400)Figure 2 The pathological changes of pulmonary tissues by Masson staining (×400)
2.4 肺組織組蛋白3乙?；?/h3>
Western blot檢測組蛋白3、乙?；M蛋白3(acetylated histone 3,AcH3)表達,通過乙?；M蛋白3/組蛋白3計算組蛋白3乙?；?。結果顯示,博來霉素組組蛋白3乙?；曙@著低于空白對照組(0.859±0.188vs0.900±0.203,P=0.049);博來霉
素組組蛋白3乙?；曙@著低于鹽水組(0.859±0.188vs1.076±0.165,P=0.000,見圖3)。
與空白對照組比較,*P<0.05;與鹽水組比較,##P<0.01圖3 小鼠肺組織組蛋白3乙?；蔉igure 3 The acetylation rate of histone 3 in the lung tissue of mice
氣管給藥后,博來霉素組第7天(0.855±0.183vs1.037±0.142,P=0.041)、14天(0.797±0.224vs1.186±0.160,P=0.000)組蛋白3乙?；曙@著低于鹽水組;然而,第21天兩組無顯著差異(0.927± 0.159vs0.951±0.103,P=0.832,見圖4)。組蛋白3乙?；什﹣砻顾亟M谷值出現在第14天,第21天逐漸回升至正常;鹽水組峰值出現在第14天,21天逐漸下降至正常,兩組變化趨勢相反。
2.5 肺組織組蛋白4乙?；?/h3>
Western blot檢測組蛋白4、乙?；M蛋白4(acetylated histone 4,AcH4)表達,通過乙?；M蛋白4/組蛋白4計算組蛋白4乙?；?。博來霉素組組蛋白4顯著低于空白對照組(0.971±0.067vs1.016±0.096,P=0.043);博來霉素組組蛋白4顯著低于鹽水組(0.971±0.067vs1.039±0.097,P=0.003,見圖5)。
博來霉素組組蛋白4乙?；试跉夤芙o藥后第7天(0.976±0.091vs1.094±0.121,P=0.006)、第14天(0.932±0.026vs1.017±0.060,P=0.045)顯著低于鹽水組;第21天兩組無顯著差異(1.002±0.044vs0.980±0.068,P=0.662,見圖6)。博來霉素組組蛋白4乙?；使戎党霈F在第14天,與鹽水組比較變化趨勢相異(見圖6)。
與鹽水組比較,*P<0.05,**P<0.01B.各組小鼠肺組織組蛋白3乙?；实谋容^圖4 小鼠肺組織組蛋白3乙?；孰S給藥時間的變化Figure 4 Changes of histone 3 acetylation rate in the lung tissues of mice along with the administration time
與空白對照組比較,*P<0.05;與鹽水組比較,##P<0.01圖5 小鼠肺組織組蛋白4乙?；蔉igure 5 The changes of histone 4 acetylation rate in the lung tissue of mice
2.6 小鼠肺組織病理評分與組蛋白乙?；嚓P性
組蛋白3乙?；逝c肺泡炎評分負相關(r=-0.458,P雙側=0.002);與肺纖維化評分不存在相關性(見圖7)。組蛋白4乙?；逝c肺泡炎(r=-0.495,P雙側=0.001)、纖維化(r=-0.396,P雙側=0.010)病理評分均呈負相關(見圖7)。
圖7 小鼠肺組織組蛋白乙?；逝c病理評分相關性Figure 7 Correlation between histone acetylation rate and pathological scores in the lung tissues of mice
2.7 組蛋白乙?；瘜Ψ卫w維化病變影響
二元線性回歸分析:以肺泡炎評分作為因變量,自變量組蛋白4乙?；?、組蛋白3乙?；蕵藴驶禂捣謩e為-0.422、-0.362,均P<0.01,標準化系數絕對值組蛋白4乙?；蚀笥诮M蛋白3乙?；?提示乙?；式档蛯Ψ闻菅椎淖饔?組蛋白4強于組蛋白3。以纖維化評分作為因變量,組蛋白4乙?；逝c纖維化評分呈負相關(r=-0.412,P=0.010),組蛋白3乙?；逝c纖維化評分無相關性,提示乙?；式档蛯Ψ卫w維化作用,組蛋白4強于組蛋白3。
與鹽水組比較,*P<0.05,**P<0.01B.小鼠肺組織組蛋白4乙?；试跉夤芙o藥后的比較圖6 小鼠肺組織組蛋白4乙?；孰S時間的變化Figure 6 Changes of histone 4 acetylation rate in the lung tissue of mice along with the administration time
3 討論
肺纖維化的病理過程包括肺實質的慢性炎癥和纖維細胞外基質的沉積,導致肺泡壁增厚,導致出現慢性不可逆的肺功能下降。典型癥狀包括干咳、氣短和運動受限[7]?？諝馕廴?、吸煙和病毒感染被認為可能是造成肺纖維化的原因,然而迄今為止,肺纖維化的發病機制仍然不完全清楚,阻止肺纖維化進展的藥物方案仍然有限[8]。本研究主要探索肺纖維化可能涉及的分子變化。研究表明組蛋白乙?；?去乙?；胶庠诶w維化進程及其基因調控中起重要作用[9],組蛋白去乙?；揎椊M蛋白,可以改變染色質構型,調控基因表達,其平衡失控是纖維化發生、發展的主要驅動力[10]。在臟器纖維化的進程中,組蛋白去乙?；羌毎幕罨?、分化、凋亡基因轉錄的關鍵開關。
博來霉素處理肺纖維化小鼠的肺成纖維細胞中,因組蛋白去乙?；?和組蛋白去乙?；?的表達升高導致的組蛋白乙?；浇档?進而導致凋亡因子Fas表達下降,促使肺成纖維細胞凋亡敏感性降低,從而抑制成纖維細胞的凋亡,促進肺纖維化的發生[11]。研究顯示組蛋白去乙?；瘷C制與抑制抗纖維化因子COX-2、IP-10啟動子區的異染色質蛋白1、以及Thy-1等關系密切[4,12],通過乙?；降母淖?調控基因的表達,進而影響纖維化的形成。
本研究通過博來霉素誘導建立肺纖維化動物模型,檢測肺組織組蛋白3、組蛋白4乙?；?及二者隨肺泡炎到肺纖維化的動態改變。結果顯示,發生肺纖維化時,肺組織組蛋白3、組蛋白4的乙?；骄档?這一變化與既往文獻基本一致。在肺成纖維細胞體外實驗中,組蛋白3和/或組蛋白4在LPS誘導的肺纖維化過程中乙?；浇档蚚12]。
本研究顯示小鼠肺纖維化早期(給藥7 d)組蛋白3、組蛋白4的乙?；匠蔬M行性下降趨勢,隨后逐漸回升。組蛋白3與組蛋白4相比較,組蛋白4乙?；磻鼮槊舾?肺纖維化早期組蛋白4乙?；较陆蹈鼮轱@著,回升更為迅速。相關性分析提示,組蛋白4去乙?；扰c肺泡炎關系密切,也與肺纖維化關系密切,組蛋白3去乙?；诜卫w維化的進程中僅與肺泡炎關系密切;多元回歸分析顯示,組蛋白3去乙酰與肺泡炎的密切性弱于組蛋白4去乙?；?。本研究初步探索組蛋白去乙?；瘏⑴c肺纖維化進程,組蛋白4與組蛋白3比較,去乙?；磻鼮槊舾?、影響更為廣泛。組蛋白4乙?；鳛槔w維化的標記,研究也更為廣泛,新近的研究顯示,丙戊酸作為組蛋白去乙?；割愐种苿?能夠顯著減少心房的擴張和纖維化;與其能夠顯著升高心房中組蛋白4乙?；接嘘P[13]。
本研究中,組蛋白乙?；皆诜卫w維化過程中后期出現回升,組蛋白4乙?；噬踔脸霈F反超對照組的現象。在腎臟損傷研究中,損傷后近端腎小管細胞中乙?；M蛋白瞬時減少,24 h后逐漸恢復,這一變化可持續3周[14],同時發現這一變化與管狀上皮細胞的修復相關[15]。因此,本研究結果提示在肺纖維化變化的過程中,組蛋白由早期的去乙?；D變為乙?；?。
另外,本研究發現,鹽水組與空白對照組小鼠比較,組蛋白乙?；缴?組蛋白3乙?；缴吒鼮槊黠@,病程早期即迅速升高;組蛋白4乙?；咚讲伙@著。因試驗設計要驗證博來霉素氣管給藥的造模效果,需設立給藥溶劑組即鹽水組進行對照,以排除溶劑對造模效果的影響。但是鹽水氣管給藥也并非生理過程,對呼吸系統屬于一種物理刺激。這一結果提示一方面鹽水氣管給藥作為一種物理刺激,誘發肺組織組蛋白乙?；揭贿^性升高,組蛋白3乙?；诖诉^程中反應更為敏感、迅速;另一方面,鹽水作為誘導藥物博來霉素的溶劑,并沒有促進組蛋白乙?；较陆档淖饔?這從側面反應博來霉素誘導肺纖維化模型,組蛋白乙?；浇档?結果可信。
總之,本研究揭示肺纖維化的表觀遺傳學發病機制的冰山一角,組蛋白3與組蛋白4的乙?；兓疃葏⑴c肺纖維化進程,為通過調控組蛋白乙?；街委煼卫w維化,甚至逆轉病程,找到了可靠的檢測標記。此外,組蛋白乙酰轉移酶對組蛋白乙?；骄哂姓{控作用,本研究為針對該乙酰轉移酶制定的肺纖維化藥物提供了可靠的治療參考標記[16],為后續相關研究的開展打下基礎。
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本研究擬通過博來霉素氣管給藥建立模擬肺纖維化的小鼠模型,在病程進展過程中,動態監測肺組織炎癥/纖維化程度及組蛋白3和組蛋白4乙?；?以明確肺纖維化過程中組蛋白3和組蛋白4乙?；诜谓M織炎癥/纖維化過程中的變化情況,為探明肺纖維化潛在的機制變化,及后續靶點的尋找提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
博來霉素A2(日本化藥株式會社,日本),Masson染色試劑盒(索萊寶生物科技有限公司),蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)，總組蛋白3抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國)，總組蛋白4抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國)，乙?；M蛋白3抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國)和乙?；M蛋白4抗體(CST，賽信通生物試劑有限公司，美國)，PCNA抗體(碧云天生物技術有限公司),TBS溶液(索萊寶生物科技有限公司)。
1.2 肺纖維化的小鼠模型建立
6-7周齡雄性C57BL/6J小鼠,SPF級,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號:SCXK(京)2012-0001),飼養于首都醫科大學動物部(許可證號:SCXK(京)2015-0012)清潔級動物房。所有動物實驗經首都醫科大學動物實驗及實驗動物福利委員倫理審查通過(倫理編號:AEEI-2016-005)。獨立通氣籠盒(individual ventilated cages,IVC)系統,飼養密度<5只/籠,12 h光照/12 h黑暗,室溫21-22 ℃,相對濕度50%-70%,自由飲水、攝食。
6-7周齡雄性C57BL/6J小鼠48只,隨機分為博來霉素組、鹽水組和正常對照組。腹腔注射10%水合氯醛(3.5 μl/g體質量)麻醉小鼠,單次氣管內給藥,博來霉素組給予博來霉素A2生理鹽水溶液2.5 μl/g體質量(相當于5 mg/kg體質量)[5],鹽水組給予生理鹽水溶液2.5 μl/g體質量。自由喂養。于氣管給藥后第7,14,21天,各組隨機選取動物依次處死、取肺。
1.3 組織學檢查
將10%甲醛緩慢注入新鮮肺組織,至肺充盈漲大(內固定),迅速置于10%甲醛固定不低于24 h。將肺組織包埋在石蠟中,制備切片(4 μm),分別進行HE染色和Masson三色染色。
采用肺泡炎分級評分[5]評估HE染色肺泡炎癥。100倍視野下,選取所有視野進行評分,視野選取應避開大氣管與大血管,取所有視野評分值的均數作為該樣本炎癥評分,采用盲評方法。
Masson染色肺組織用于纖維化分級評分[6]。100倍顯微鏡下,拍攝所有視野照片,每個視野隨機放大40倍顯微照片一張,放大視野選取避開大氣管與大血管,取所放大照片評分值的均數作為該樣本纖維化分級評分,采用盲評方法。
1.4 組蛋白3、4乙?；蕶z測
Western blot檢測總組蛋白3(1 ∶1 000稀釋,CST,#9715),總組蛋白4(1 ∶500稀釋,CST,#2592),乙?；M蛋白3(1 ∶1 000稀釋,CST,#9649)和乙?；M蛋白4(1 ∶500稀釋,CST,#13534)的表達,以PCNA(1 ∶1 000稀釋,碧云天,AF0261)作為內部參照,使目標蛋白表達標準化。使用SDS-PAGE(分離膠12%,積層膠5%)分離變性核蛋白樣品(100 ℃,5 min;每個泳道50 μg)。通過電轉印跡將蛋白轉移到PVDF膜上。室溫用含有5%脫脂奶粉的TBS溶液封閉2 h。在4 ℃下,一級抗體孵育過夜。加二級抗體是熒光羊抗兔IgG(1 ∶10 000)或熒光羊抗鼠IgG(1 ∶10 000),室溫孵育2 h。使用Odyssey LI-COR SA雙色紅外激光成像系統掃描成像,分析蛋白條帶。組蛋白乙?；?乙?；M蛋白/總組蛋白。
1.5 統計學分析
2 結果
2.1 實驗小鼠一般情況
小鼠造模后飼養過程中,存在自然死亡,博來霉素組死亡8只、鹽水組死亡2只、空白對照組死亡0只。博來霉素組4只小鼠發生下肢運動障礙,均伴有下肢皮膚紫紺、脫毛、肌肉萎縮、皮溫厥冷。
2.2 肺泡炎評分
通過對小鼠肺組織進行HE染色觀察各組肺泡炎情況,結果發現,肺泡炎癥博來霉素組明顯重于鹽水組,博來霉素組廣泛肺泡結構破壞,肺泡間隔明顯增厚,實質區明顯增多,肺泡內及間質炎性細胞浸潤,給藥后7 d病變呈局灶性,給藥后14 d呈彌漫性>20%肺組織,嚴重時>50%肺組織,伴有出血(紅色箭頭),肺大泡(向左箭頭),甚至官腔閉合(三角箭頭),給藥后21 d時肺組織病變更重(見圖1)。博來霉素組在氣管給藥后7,14,21 d時肺泡炎評分均顯著高于鹽水組(見表1)。博來霉素組肺泡炎評分峰值出現在第14天,第7天與第14天差異顯著。說明博來霉素氣管給藥,誘導肺泡炎,持續進展,給藥后第14天達到高峰,隨后趨于平穩,逐漸下降。
圖1 小鼠肺組織病理HE染色鏡下表現 (×400)Figure 1 HE staining of pulmonary tissues in mice (×400)
表1 各組肺泡炎評分比較
2.3 肺纖維化評分
通過對小鼠肺組織進行Masson染色觀察各組肺纖維化情況,結果顯示,博來霉素組肺纖維化明顯重于鹽水組,博來霉素組肺組織結構紊亂,肺泡間隔廣泛增厚明顯(隔厚度≥3X正常),部分間質纖維化毗連呈墻,甚至條塊狀膠原纖維沉積于肺間質(紅色箭頭),嚴重時肺泡腔被膠原纖維填滿(實三角形),肺泡間隔消失,正常肺泡結構不能保留,膠原纖維條塊連結成片(>顯微鏡視野50%)(見圖2)。博來霉素組在氣管給藥后7,14,21 d肺纖維化評分均顯著高于鹽水組(見表2)。博來霉素組肺纖維化評分進行性升高,峰值出現在第21天。說明博來霉素氣管給藥后,纖維化持續進展,給藥后7-14 d變化急劇,14-21 d變化趨于平穩。
表2 各組肺纖維化評分比較
圖2 小鼠肺組織病理Masson染色鏡下表現 (×400)Figure 2 The pathological changes of pulmonary tissues by Masson staining (×400)
2.4 肺組織組蛋白3乙?；?/h3>
Western blot檢測組蛋白3、乙?；M蛋白3(acetylated histone 3,AcH3)表達,通過乙?；M蛋白3/組蛋白3計算組蛋白3乙?；?。結果顯示,博來霉素組組蛋白3乙?；曙@著低于空白對照組(0.859±0.188vs0.900±0.203,P=0.049);博來霉
素組組蛋白3乙?；曙@著低于鹽水組(0.859±0.188vs1.076±0.165,P=0.000,見圖3)。
與空白對照組比較,*P<0.05;與鹽水組比較,##P<0.01圖3 小鼠肺組織組蛋白3乙?；蔉igure 3 The acetylation rate of histone 3 in the lung tissue of mice
氣管給藥后,博來霉素組第7天(0.855±0.183vs1.037±0.142,P=0.041)、14天(0.797±0.224vs1.186±0.160,P=0.000)組蛋白3乙?；曙@著低于鹽水組;然而,第21天兩組無顯著差異(0.927± 0.159vs0.951±0.103,P=0.832,見圖4)。組蛋白3乙?；什﹣砻顾亟M谷值出現在第14天,第21天逐漸回升至正常;鹽水組峰值出現在第14天,21天逐漸下降至正常,兩組變化趨勢相反。
2.5 肺組織組蛋白4乙?；?/h3>
Western blot檢測組蛋白4、乙?；M蛋白4(acetylated histone 4,AcH4)表達,通過乙?；M蛋白4/組蛋白4計算組蛋白4乙?；?。博來霉素組組蛋白4顯著低于空白對照組(0.971±0.067vs1.016±0.096,P=0.043);博來霉素組組蛋白4顯著低于鹽水組(0.971±0.067vs1.039±0.097,P=0.003,見圖5)。
博來霉素組組蛋白4乙?；试跉夤芙o藥后第7天(0.976±0.091vs1.094±0.121,P=0.006)、第14天(0.932±0.026vs1.017±0.060,P=0.045)顯著低于鹽水組;第21天兩組無顯著差異(1.002±0.044vs0.980±0.068,P=0.662,見圖6)。博來霉素組組蛋白4乙?；使戎党霈F在第14天,與鹽水組比較變化趨勢相異(見圖6)。
與鹽水組比較,*P<0.05,**P<0.01B.各組小鼠肺組織組蛋白3乙?；实谋容^圖4 小鼠肺組織組蛋白3乙?；孰S給藥時間的變化Figure 4 Changes of histone 3 acetylation rate in the lung tissues of mice along with the administration time
與空白對照組比較,*P<0.05;與鹽水組比較,##P<0.01圖5 小鼠肺組織組蛋白4乙?；蔉igure 5 The changes of histone 4 acetylation rate in the lung tissue of mice
2.6 小鼠肺組織病理評分與組蛋白乙?；嚓P性
組蛋白3乙?；逝c肺泡炎評分負相關(r=-0.458,P雙側=0.002);與肺纖維化評分不存在相關性(見圖7)。組蛋白4乙?；逝c肺泡炎(r=-0.495,P雙側=0.001)、纖維化(r=-0.396,P雙側=0.010)病理評分均呈負相關(見圖7)。
圖7 小鼠肺組織組蛋白乙?；逝c病理評分相關性Figure 7 Correlation between histone acetylation rate and pathological scores in the lung tissues of mice
2.7 組蛋白乙?；瘜Ψ卫w維化病變影響
二元線性回歸分析:以肺泡炎評分作為因變量,自變量組蛋白4乙?；?、組蛋白3乙?；蕵藴驶禂捣謩e為-0.422、-0.362,均P<0.01,標準化系數絕對值組蛋白4乙?；蚀笥诮M蛋白3乙?；?提示乙?；式档蛯Ψ闻菅椎淖饔?組蛋白4強于組蛋白3。以纖維化評分作為因變量,組蛋白4乙?；逝c纖維化評分呈負相關(r=-0.412,P=0.010),組蛋白3乙?；逝c纖維化評分無相關性,提示乙?；式档蛯Ψ卫w維化作用,組蛋白4強于組蛋白3。
與鹽水組比較,*P<0.05,**P<0.01B.小鼠肺組織組蛋白4乙?；试跉夤芙o藥后的比較圖6 小鼠肺組織組蛋白4乙?；孰S時間的變化Figure 6 Changes of histone 4 acetylation rate in the lung tissue of mice along with the administration time
3 討論
肺纖維化的病理過程包括肺實質的慢性炎癥和纖維細胞外基質的沉積,導致肺泡壁增厚,導致出現慢性不可逆的肺功能下降。典型癥狀包括干咳、氣短和運動受限[7]?？諝馕廴?、吸煙和病毒感染被認為可能是造成肺纖維化的原因,然而迄今為止,肺纖維化的發病機制仍然不完全清楚,阻止肺纖維化進展的藥物方案仍然有限[8]。本研究主要探索肺纖維化可能涉及的分子變化。研究表明組蛋白乙?；?去乙?；胶庠诶w維化進程及其基因調控中起重要作用[9],組蛋白去乙?；揎椊M蛋白,可以改變染色質構型,調控基因表達,其平衡失控是纖維化發生、發展的主要驅動力[10]。在臟器纖維化的進程中,組蛋白去乙?；羌毎幕罨?、分化、凋亡基因轉錄的關鍵開關。
博來霉素處理肺纖維化小鼠的肺成纖維細胞中,因組蛋白去乙?；?和組蛋白去乙?；?的表達升高導致的組蛋白乙?；浇档?進而導致凋亡因子Fas表達下降,促使肺成纖維細胞凋亡敏感性降低,從而抑制成纖維細胞的凋亡,促進肺纖維化的發生[11]。研究顯示組蛋白去乙?；瘷C制與抑制抗纖維化因子COX-2、IP-10啟動子區的異染色質蛋白1、以及Thy-1等關系密切[4,12],通過乙?；降母淖?調控基因的表達,進而影響纖維化的形成。
本研究通過博來霉素誘導建立肺纖維化動物模型,檢測肺組織組蛋白3、組蛋白4乙?；?及二者隨肺泡炎到肺纖維化的動態改變。結果顯示,發生肺纖維化時,肺組織組蛋白3、組蛋白4的乙?；骄档?這一變化與既往文獻基本一致。在肺成纖維細胞體外實驗中,組蛋白3和/或組蛋白4在LPS誘導的肺纖維化過程中乙?；浇档蚚12]。
本研究顯示小鼠肺纖維化早期(給藥7 d)組蛋白3、組蛋白4的乙?；匠蔬M行性下降趨勢,隨后逐漸回升。組蛋白3與組蛋白4相比較,組蛋白4乙?；磻鼮槊舾?肺纖維化早期組蛋白4乙?；较陆蹈鼮轱@著,回升更為迅速。相關性分析提示,組蛋白4去乙?；扰c肺泡炎關系密切,也與肺纖維化關系密切,組蛋白3去乙?；诜卫w維化的進程中僅與肺泡炎關系密切;多元回歸分析顯示,組蛋白3去乙酰與肺泡炎的密切性弱于組蛋白4去乙?；?。本研究初步探索組蛋白去乙?；瘏⑴c肺纖維化進程,組蛋白4與組蛋白3比較,去乙?；磻鼮槊舾?、影響更為廣泛。組蛋白4乙?；鳛槔w維化的標記,研究也更為廣泛,新近的研究顯示,丙戊酸作為組蛋白去乙?；割愐种苿?能夠顯著減少心房的擴張和纖維化;與其能夠顯著升高心房中組蛋白4乙?；接嘘P[13]。
本研究中,組蛋白乙?；皆诜卫w維化過程中后期出現回升,組蛋白4乙?；噬踔脸霈F反超對照組的現象。在腎臟損傷研究中,損傷后近端腎小管細胞中乙?；M蛋白瞬時減少,24 h后逐漸恢復,這一變化可持續3周[14],同時發現這一變化與管狀上皮細胞的修復相關[15]。因此,本研究結果提示在肺纖維化變化的過程中,組蛋白由早期的去乙?；D變為乙?；?。
另外,本研究發現,鹽水組與空白對照組小鼠比較,組蛋白乙?；缴?組蛋白3乙?；缴吒鼮槊黠@,病程早期即迅速升高;組蛋白4乙?；咚讲伙@著。因試驗設計要驗證博來霉素氣管給藥的造模效果,需設立給藥溶劑組即鹽水組進行對照,以排除溶劑對造模效果的影響。但是鹽水氣管給藥也并非生理過程,對呼吸系統屬于一種物理刺激。這一結果提示一方面鹽水氣管給藥作為一種物理刺激,誘發肺組織組蛋白乙?；揭贿^性升高,組蛋白3乙?；诖诉^程中反應更為敏感、迅速;另一方面,鹽水作為誘導藥物博來霉素的溶劑,并沒有促進組蛋白乙?；较陆档淖饔?這從側面反應博來霉素誘導肺纖維化模型,組蛋白乙?；浇档?結果可信。
總之,本研究揭示肺纖維化的表觀遺傳學發病機制的冰山一角,組蛋白3與組蛋白4的乙?；兓疃葏⑴c肺纖維化進程,為通過調控組蛋白乙?；街委煼卫w維化,甚至逆轉病程,找到了可靠的檢測標記。此外,組蛋白乙酰轉移酶對組蛋白乙?；骄哂姓{控作用,本研究為針對該乙酰轉移酶制定的肺纖維化藥物提供了可靠的治療參考標記[16],為后續相關研究的開展打下基礎。
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