黑果枸杞中花色苷的高效液相色譜分析研究

王天琦， 馬兆成， 吳軍民， 王建國， 余瓊衛*， 馮鈺锜

(1.生物醫學分析化學教育部重點實驗室，武漢大學化學與分子科學學院，湖北武漢 430072；2.華中農業大學園藝林學學院 園藝生物學教育部重點實驗室，湖北武漢 430070；3.青海芝潤農林開發有限公司，青海格爾木 816099；4.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100)

圖1 花青素的化學結構Fig.1 Chemical structure of anthocyanins

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)為茄科(Solanceae)枸杞屬(LyciumL.)多年生灌木，廣泛分布于我國西北地區，其果實中富含花青素，具有抗氧化、抗癌、維持血管通透性的作用[1]?；ㄇ嗨貙儆陬慄S酮物質，具有2-苯基苯并吡喃陽離子的典型結構(圖1)，是植物的主要水溶性色素之一。目前已知有20多種花青素，而植物中的花青素主要有6種，分別為天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素[2]?；ㄇ嗨卦谥参镏型ǔ２环€定，不會以游離態形式存在，而是與糖類物質結合形成糖苷，稱為花色苷。糖環上剩余的羥基又會與酸發生?；磻?，這大大增加了花色苷類物質的穩定性[3]。通過提取植物中花青素苷并對其進行分析，可以間接地了解植物中花青素的情況。

黑枸杞中花青素的提取多采用溶劑提取法，由于花青素在pH>3的環境中不穩定，用酸化的甲醇或乙醇與水的混合溶劑，輔以超聲、微波、水浴等協助提取[4,5]。還有部分研究采用微生物法[6]，即利用微生物或酶降解細胞壁，使細胞內的花青素釋放出來，達到快速測定花青素的目的。關于溶劑提取法，目前已有多篇文獻報道用以提取花青素，但這些報道中用到的溶劑、酸度、輔助方式均不相同，很難達到統一[3,7 - 12]?；ㄇ嗨氐臏y定方法主要有分光光度法[7,12]、高效液相色譜法[13 - 15]、質譜法[16]。然而，由于這些花色苷是復雜的糖基化、?；幕衔?，提純和合成都較困難，無法得到標準品[17]，因而多采用已有的花色苷標準品進行儀器分析做線性標準曲線，然后再將該線性曲線用于沒有標準品結構相似的花青素苷的半定量分析。Zheng等[3]用高效液相色譜-電噴霧質譜(HPLC-ESI-MS)從黑枸杞提取液中鑒定出14種花色苷，并以錦葵色素-3,5-2-O -葡萄糖苷(Malvidin-3,5-di-O -glucoside)對這14種花色苷進行半定量分析。

本文首先通過高效液相色譜-電噴霧質譜分離鑒定，確證提取液色譜圖中各個峰的結構，確定其中的花色苷，再以高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)對其進行提取條件的優化及分析。在優化后的提取條件下，以矢車菊素-3-O -葡萄糖苷(Cyanidin-3-O -glucoside)為對照品對黑枸杞中總花色苷進行了半定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Shimadzu 20A高效液相色譜儀(日本，島津公司)；Shimadzu 8040 MS質譜儀(日本，島津公司)。

標準品矢車菊素-3-O -葡萄糖苷(Cyanidin-3-O -glucoside)購自上海麥克林生化科技有限公司。色譜純甲醇購自美國TEDIA試劑公司；甲醇、乙醇、甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水由Milli-Q超純水儀制備。

黑枸杞購自湖北省武漢市超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的制備稱取5.0 mg標準品矢車菊素-3-O -葡萄糖苷(Cyanidin-3-O -glucoside)，置于15.0 mL棕色安普瓶中，加入5.0 mL 1%HCl酸化的甲醇溶液超聲溶解，得到1 mg/mL的標準品儲備液，于-20 ℃避光冷藏。

1.2.2 黑枸杞中花色苷的提取稱取黑枸杞樣品7 g于小燒杯中，45 ℃下置于真空干燥箱中干燥72 h，將干燥后的黑枸杞置于研缽中，加入液氮磨碎成粉末，于-20 ℃避光保存。準確稱取50 mg黑枸杞粉末于1.5 mL離心管中，以1∶15的液料比加入750 μL 2%甲酸甲醇(甲酸∶甲醇=2∶98)，于室溫下避光浸提24 h。8 000 r/min離心10 min，取上清液進入HPLC儀檢測。

1.2.3 色譜及質譜條件色譜條件：上海譜寧科技公司Pntulips SBP-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm)。流動相A為甲醇，B為含0.5%甲酸水溶液。梯度淋洗程序：0～3 min，80%～70%B；3～13 min，70%～60%B；13～25 min，60%～50%B，25～35 min，50%B；35～40 min，50%～80%B；40～60 min，50%～80%B；流速為0.8 mL/min。柱溫30 ℃；檢測波長為525 nm；進樣量為10 μL。質譜條件：采用電噴霧電離、正離子掃描，掃描范圍為0～1 200 Da，脫溶劑(DL)管溫度250 ℃，加熱模塊溫度400 ℃，霧化氣流速3 mL/min，干燥氣流速15 mL/min。

2 結果與討論

2.1 花色苷質譜鑒定

圖2 黑枸杞提取液的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of L.ruthenicum extractsflow rate:0.8 mL/min;column temperature:30 ℃;wavelength:525 nm;injection amount:10 μL.The mobile phase of the gradient elution was as shown in 1.2.3.

圖2為黑枸杞中花色苷提取液的色譜分離圖，圖中主要有9個色譜峰，用島津8040質譜儀進行質譜鑒定。對于圖2中的9個色譜峰，根據其得到的全掃描質譜以及二級質譜圖，可以得到相對應的結構信息。經過結構解析與文獻報道[3,15,18,19]對比，4號峰(P4)與7號峰(P7)鑒定為花色苷，分別為矮牽?；?3-O -蕓香糖苷(葡糖基-P-香豆?；?-5-O -葡萄糖苷(Petunidin-3-O -rutinoside(glucosyl-p-coumaroyl)-5-O -glucoside)和矮牽?；?3-O -蕓香苷-5-O -葡萄糖苷(Petunidin-3-O -rutinoside(p-coumaroyl)-5-O -glucoside)，且其峰面積之和占總峰面積的90%左右。之后，依據P4和P7的峰面積之和對黑枸杞中花色苷總量進行半定量分析。

P4的二級質譜圖見圖3A，分子離子峰的質荷比為1094.8，丟失C5上連接的一個葡萄糖分子后得到的離子質荷比為932.9，丟失C3上連接的蕓香糖、對香豆酸、葡萄糖得到的離子質荷比為478.8，最后得到的牽?；ㄉ貫橘|荷比317.0的峰。P7的二級質譜圖見圖3B，分子離子峰的質荷比為933.0，丟失C5上連接的一個葡萄糖分子后得到的離子質荷比為771.0，丟失C3上連接的蕓香糖、對香豆酸得到的離子質荷比為478.8，最后得到的牽?；ㄉ貫橘|荷比317.0的峰。

圖3 花色苷的質譜圖Fig.3 Mass spectra of anthocyaninsA:Petunidin-3-O -rutinoside(glucosyl-p-coumaroyl)-5-O -glucoside;B:Petunidin-3-O -rutinoside(p-coumaroyl)-5-O -glucoside.

2.2 花色苷提取的優化

從黑枸杞中提取花色苷的方法多種多樣，涉及到多種提取溶劑如甲醇、乙醇、水，也有多種提取方法如浸提、超聲、微波等被報道[3,7 - 12]。由于花色苷在中性及堿性條件下不穩定，易發生分解，多在提取液中加入酸。選取了如下7種方法對黑枸杞中花色苷的提取進行優化，具體參數見表1。按照表1進行提取操作后，得到的上清液進行HPLC-UV分離檢測。檢測結果見圖4，橫坐標為提取方法序號。1號、5號、6號方法的提取效果較好，3、7號方法的提取效果較差。綜合考慮實驗操作的安全性、實驗效果等方面，在之后的實驗中采取1號方法進行提取。

表1 黑枸杞中花色苷提取方法

圖4 花色苷的提取優化Fig.4 Optimization of anthocyanins extraction methods1-7 represented seven different extraction methods shown in Table 1,respectively.

2.3 標準工作曲線

分別以2%甲酸甲醇溶液為溶劑配制濃度為0.020、0.050、0.080、0、100、0.200、0.800 mg/mL的矢車菊素-3-O -葡萄糖苷標準溶液。按照優化條件進行HPLC-UV檢測。以峰面積為縱坐標，質量濃度(mg/mL)為橫坐標，得到線性回歸方程為：y=2.00×107x-15 691，相關系數R2為0.9996。以3倍信噪比(S/N=3)計算得到儀器檢出限為0.17 μg/mL，以S/N=10得到定量限為0.56 μg/mL。

在后續的計算中將P4與P7的峰面積之和代入線性回歸方程，得到的花色苷總濃度單位為mg Cy/g黑枸杞(Cy指代矢車菊素-3-O -葡萄糖苷)。

2.4 方法學考察

2.4.1 穩定性實驗取同一矢車菊素-3-O -葡萄糖苷標準品溶液，分別放置0、1、2、3、4、5、6、10、16、24 h后進行檢測，計算樣品中總花色苷峰面積的相對標準偏差(RSD)為1.76%，表明花色苷樣品在24 h內保持穩定(表2)。

2.4.2 回收率實驗向提取前的黑枸杞試樣中加入濃度為1 mg/mL的標準溶液75 μL，與未加標的黑枸杞試樣一樣處理，得到上清液后，向未加標的試樣中加入等量標品，進入HPLC檢測。重復三次，回收率為89.18%，RSD為5.72%，見表2。均可滿足檢測要求。

2.4.3 精密度實驗按照提取方法進行黑枸杞中花色苷的提取，重復三次，得到花色苷峰面積的日內精密度為1.96%；于3 d內連續進行此實驗，得到日間精密度為7.37%(表2)。均符合檢測要求。

表2 分析方法的精密度、穩定性以及加標回收率

2.5 實際樣品分析

購買10種不同品牌黑枸杞產品，產地均為青海省，分別編號1～10，按擬定方法進行提取，優化方法進行檢測，結果列于表3。這10種黑枸杞均產自青海省，但來自不同的市、區，主要為海西蒙古藏族自治州(格爾木市、諾木洪)和果洛藏族自治州，他們的價格差異巨大。一般來說，野生的黑枸杞價格貴于種植的，且顆粒越大價格越高。按照行業標準，顆粒直徑3～4 mm的為小果，4～6 mm為中果，6～8 mm為大果。根據單因素方差分析結果，10種黑枸杞中花色苷含量存在顯著性差異，說明不同品牌之間的黑枸杞花色苷含量差異巨大。將5、7、9號樣品歸于一組，為中果組，6、8、10號樣品歸于一組，為大果組，進行統計學分析，發現兩組數據之間并不存在顯著性差異，且同一品牌不同大小黑枸杞中也不存在顯著性差異，即黑枸杞中總花色苷的含量與黑枸杞的顆粒大小并無明確關系。

表3 黑枸杞實際樣品中花色苷檢測結果

3 結論

本文對提取液中的花色苷進行質譜鑒定，鑒別出兩種花色苷，分別為矮牽?；?3-O -蕓香糖苷(葡糖基-P-香豆?；?-5-O -葡萄糖苷和矮牽?；?3-O -蕓香苷-5-O -葡萄糖苷，均含有牽?；ㄉ?。實驗在前人的基礎上對比優化了黑枸杞中總花色苷的提取方法，最終采取以2%甲酸甲醇為溶劑，常溫下避光浸提24 h的方法。隨后建立了黑枸杞中總花色苷的半定量方法，以矢車菊素-3-O -葡萄糖苷標準品溶液建立工作曲線，方法學考察結果良好。檢測了10種不同品牌的黑枸杞產品，發現總花色苷含量均在2.0 mg Cy/g黑枸杞以上，且不同品牌之間差異巨大。但是花色苷含量與黑枸杞顆粒大小、實際售賣價格均無明顯關系。