聚乙烯亞胺官能化核-殼型磁性鈷納米粒/血紅蛋白傳感器制備及過氧化氫的測定

裴新月， 黎夏彤， 樊 璨， 舒 婷， 吳 詩， 閔 清， 王 詩*

(湖北科技學院藥學院，湖北咸寧 437100)

電化學生物傳感器在臨床診斷、農殘分析、食品藥品工業等領域具有廣泛的應用前景。在電化學生物傳感器的研制中，一個關鍵的技術就是如何將生物材料穩定、高活性地固定到基體電極表面，構成傳感器的敏感膜。近年來磁性納米粒(Magnetic Nanoparticles，MNPs)由于其兼具納米粒的表面與界面效應，以及特殊的磁學性質成為研究的熱點。MNPs以磁性材料為中心，在其表面連接生化活性功能基團，不但具備良好的磁導向性，也具有良好的生物相容性[1]。將MNPs作為固定化載體，在外加磁場的作用下可將生物材料定位于電極表面[2,3]，應用于酶傳感器[4,5]、免疫傳感器[6,7]、DNA傳感器[8]等生物傳感器中。

目前MNPs的使用以鐵及鐵系氧化物居多[9]，但Fe、Fe3O4很容易被氧化成γ-Fe2O3，導致粒子發生聚集和沉淀，不能形成穩定的分散體系，限制了其應用。通過對MNPs進行修飾，如外包高分子形成核-殼結構，可以降低其表面能，得到分散性良好的MNPs[10,11]。因為利用殼結構不僅保護磁性核心納米顆粒不受環境影響降解，也防止聚結[12]。在殼的外層修飾連接功能化基團，如羥基、胺和氨基，有利于MNPs在水性介質中形成更穩定的分散體[13 - 15]。血紅蛋白(Hb)在生命活動和生物代謝過程中起著重要的作用，由于其具有過氧化物酶和細胞色素P450的生物催化作用，是研究生物大分子電化學的理想模型物。但Hb直接固定在電極上變性失活，且電子轉移率低。本研究制備了聚乙烯亞胺(PEI)官能化的核-殼型磁性鈷納米粒(Co@C-PEI MNPs)，利用Co@C-PEI MNPs良好的磁性和生物相容性固載Hb，制備Hb/Co@C-PEI MNPs修飾的絲網印刷傳感器(Hb/Co@C-PEI/SPE)。配合實驗室自制的反應池，將Hb/Co@C-PEI/SPE用于H2O2的測定，取得良好效果。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

CHI660E電化學工作站(上海辰華)；JB-2磁力攪拌器(上海雷磁)；UV-8000紫外分光光度計(日本，島津)；Quanta 250掃描電鏡(美國，FEI)；Tecnai-G2-TwinF20能譜掃描儀(美國，FEI)；JEM-2010FEF透射電鏡(日本，JEOL)；XRD -6000X射線衍射儀(日本，島津)。實驗室用多功能絲網印刷設備(珠海凱為)。

絲網印刷ED 423SS碳油墨、ED 427SS銀油墨、CNC-01 Ag/AgCl油墨及ED 452SS BLUE絕緣油墨，均購于美國Acheson；PVC片材(上海新立)；碳包覆鈷納米粒(Turbobeads Llc)；豬血紅蛋白(上海源葉)；H2O2(Sigma)每次試驗前重新配制；其他試劑均為分析純。實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 Co@C-PEI MNPs的制備依照文獻方法[16]制備Co@C-PEI MNPs：取200 mg Co@C納米粒和100 mg 3-苯基環氧乙烷-2,2-二腈(0.59 mmoL)，于120 ℃下微波加熱4 min。在磁鐵的幫助下回收冷卻顆粒，并用乙酸乙酯和乙醚洗滌。蒸發溶劑后，得到204 mg納米粒備用。在氮氣保護下于燒瓶中加入8.5 mL四氫呋喃和320 μL三甲基氯硅烷(2.56 mmoL)，攪拌的同時加入96.8 mg硼氫化鈉。將所得溶液在80 ℃下加熱4 h，冷卻至室溫后，加入160 mg備用的納米粒。將反應混合物在80 ℃加熱24 h，然后用四氫呋喃和乙醚洗滌，真空干燥后得到157 mg 氨基官能化Co@C納米粒。取該納米粒100 mg于10 mL二氯甲烷中超聲分散15 min。攪拌的同時加入778 μL二甲亞胺(15 mmoL)和15 μL的HCl，加熱至80 ℃保持24 h。使用外部磁鐵收集納米粒，然后用100 mL二氯甲烷、750 mL水洗滌，在50 ℃真空干燥即得284 mg Co@C-PEI MNPs。

1.2.2 Hb/Co@C-PEI/SPE的制備于PVC基材表面逐層套印導電銀軌、工作電極、Ag/AgCl參比電極和輔助電極，置烘箱中烘干，最后印刷絕緣層，紫外烘干。制備的絲網印刷傳感器(SPE)用水清洗，氮氣吹干備用[17]。吸取5 μL Co@C-PEI混懸液滴加在SPE的表面，SPE下方放置磁鐵，室溫干燥后即制得Co@C-PEI/SPE。取5 μL Hb溶液修飾于工作電極表面，在4 ℃下干燥，制得Hb/SPE。將Hb溶液加至Co@C-PEI混懸液中混勻，取5 μL修飾于工作電極表面，在SPE下方放置磁鐵，4 ℃下干燥后即制得Hb/Co@C-PEI/SPE，于4 ℃下保存備用。Hb/Co@C-PEI/SPE結構見圖1。

1.2.3 反應池的制備及使用反應池由二部分組成，上部分由聚二甲基硅氧烷凝固態的方體和外包有環氧樹脂的固化態外殼組成，中間開有適應SPE反應區域的孔洞；下部分由環氧樹脂固化態組成，內嵌磁鐵，通過角碼和螺絲與上部分連接(圖2內插圖)。使用時將SPE放置于下部分的表面，然后覆蓋上部分，調整SPE的位置使其反應區域(包含工作電極、參比電極及輔助電極)位于上部分的孔洞中，下部分的磁鐵位于SPE的反應區域正下方。將SPE與電化學工作站相連接，即可開始測試(圖2)。

圖1 Hb/Co@C-PEI/SPE示意圖Fig.1 Schematic diagram of Hb/Co@C-PEI /SPE

圖2 SPE放置于反應池(內插圖為反應池)Fig.2 The SPE placed in the laboratory-constructed cell(Inset:laboratory-constructed cell)

1.2.4 電化學測定方法循環伏安法(CV)掃描范圍-1.0～0.2 V；電流-時間響應實驗(i-t)工作電位為-0.46 V，間隔加樣時間為50 s。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)由NaH2PO4和Na2HPO4配制，溶液在使用前高純氮氣除氧20 min，并且在氮氣氛下進行實驗。

2 結果與討論

2.1 Co@C-PEI MNPs的表征

圖3是所制備的Co/C-PEI MNPs的典型透射電鏡(TEM)圖像?？梢钥闯鯟o/C-PEI MNPs具有核-殼結構，其尺寸范圍為20～100 nm，碳殼的厚度僅為1～3 nm。能譜(EDX)分析表明Co/C-PEI MNPs由內Co核和外碳殼組成，其中Cu的信號來自銅網。

圖3 Co@C-PEI MNPs的TEM(A-C)，EDX(D)及實物圖(E)Fig.3 TEM images(A-C)，EDX spectrum(D) and photograph(E) of the Co@C-PEI MNPs

圖4 Hb(a)和Hb/Co@C-PEI MNPs混合液(b)的UV-Vis吸收光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of Hb (a) and Hb/Co@C-PEI MNPs (b) in water

2.2 紫外-可見吸收光譜

利用紫外-可見吸收光譜吸收帶的位置和形狀觀察Hb是否變性。如圖4所示，Hb/Co@C-PEI MNPs混合溶液與Hb溶液的光譜吸收帶的形狀基本一樣，出峰位置均在405 nm處，與天然態Hb分子的Soret吸收帶一致，表明Hb在Co@C-PEI MNPs溶液中可保持自然構象。

2.3 修飾傳感器的表征

分別對未修飾傳感器(bare SPE)和Hb/Co@C-PEI修飾傳感器(Hb/Co@C-PEI/SPE)進行掃描電鏡(SEM)表征。未經過修飾的工作電極表面粗糙，含有大量分布不均勻的片層結構，布滿碳墨顆粒(圖5A)；經過修飾后，工作電極表面更為平整，可見分散的Co@C-PEI 納米粒(圖5B)，這些磁性納米粒在外加磁鐵的作用下不但有利于Hb在電極表面的富集，還能改變工作電極表面電化學特性，有利于電子在工作電極表面傳遞。

圖5 未修飾傳感器(A)和Hb/Co@C-PEI修飾的傳感器(B)的SEM圖Fig.5 SEM images of the bare SPE(A) and Hb/Co@C-PEI/SPE(B)

2.4 修飾傳感器的電化學特性

圖6 未修飾傳感器(bare SPE)(a)、血紅蛋白修飾傳感器(Hb/SPE)(b)、Co@C-PEI MNPs修飾傳感器(Co@C-PEI/SPE)(c)和Co@C-PEI MNPs/血紅蛋白修飾傳感器(Hb/Co@C-PEI/SPE)(d)在0.1 mol/L PBS中的循環伏安曲線(掃描速度：100 mV/s)Fig.6 Cyclic voltammetric curves of 0.1 mol /L PBS solution at bare SPE(a),Hb/SPE(b),Co@C-PEI/SPE(c) and Hb/Co@C-PEI/SPE(d)(scan rate:100 mV/s)

采用循環伏安法(CV)考察未修飾傳感器(bare SPE)、Co@C-PEI MNPs修飾傳感器(Co@C-PEI/SPE)、血紅蛋白修飾傳感器(Hb/SPE)和Co@C-PEI MNPs/血紅蛋白修飾傳感器(Hb/Co@C-PEI/SPE)在pH為8.0的0.1 mol/L PBS中的電化學響應。如圖6所示，Co@C-PEI/SPE與bare SPE相比背景電流增大，說明Co@C-PEI MNPs具有良好的導電性，并且具有大的比表面積。而Hb/SPE只有還原峰(-0.42 V)，無對應氧化峰出現，但Hb/Co@C-PEI/SPE在電位-0.52 V和-0.61 V出現了一對氧化還原峰。表明Co@C-PEI MNPs能保持Hb的活性，實現Hb血紅素中心Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)與電極間的直接電子轉移。通過公式：Q=nFAΓ*，計算得Hb在Hb/Co@C-PEI/SPE上的表觀覆蓋量(Γ*)為1.90×10-10mol/cm2，有活性的Hb約為電極表面Hb總量(3.68×10-9mol/cm2)的5.16%，并大于血紅蛋白理論單層覆蓋量1.89×10-11mol/cm2 [18]，說明電極表面Co@C-PEI MNPs固載了多層Hb參加了反應。

采用CV法在不同掃描速率下測定Hb/Co@C-PEI/SPE表面的電化學響應(圖7)。隨著掃描速率的增加，氧化還原峰電流也相應地增加，在40～300 mV/s掃速范圍內，其氧化峰電流與還原峰電流與掃描速度成正比，說明Hb/Co@C-PEI/SPE表面電極過程為表面控制過程。

圖7 (A)不同掃描速率下Hb/Co@C-PEI/SPE的CV響應(內→外：掃描速度分別為40,60,80,100,150,200,300 mV/s)；(B)峰電流(Ipa,Ipc)與掃描速度的線性關系Fig.7 (A) Cyclic voltammetric curves of 0.1 mol/L PBS solution at Hb/Co@C-PEI/SPE(Inner→Outer:scan rate are 40,60,80,100,150,200,and 300 mV/s,respectively);(B) The relationships of Ip(Ipa,Ipc) vs.scan rate

通過CV法考察不同pH對Hb/Co@C-PEI/SPE電化學行為的影響。在pH為4.0～10.0范圍內，隨著pH值增加，Hb的氧化還原峰的峰形幾乎不變，但氧化峰電位和還原峰電位均發生負移。當pH值為8.0時，峰電流最大，靈敏度最高。綜合考慮峰電流大小和峰形，選擇pH值為8的0.1 mol/L PBS為測定介質。

2.5 不同濃度修飾材料對Hb電化學響應的影響

圖8 Co@C-PEI MNPs濃度(A)及Hb濃度(B)對Hb電化學響應的影響Fig.8 Effects of Co@C-PEI MNPs(A) and Hb(B) on the peak current of Hb responses

采用CV法考察Hb/Co@C-PEI修飾液中Co@C-PEI MNPs濃度，以及Hb濃度對Hb電化學響應的影響。當Co@C-PEI MNPs的濃度從1.0 mg/mL增加到3.0 mg/mL時，Hb峰電流逐漸增加。當濃度超過3.0 mg/mL，Co@C-PEI MNPs的背景電流增加，Hb峰電流的靈敏度反而降低(圖8A)。Hb的濃度從1.0 mg/mL增加到5.0 mg/mL時，Hb峰電流隨著Hb的增加而增加。當濃度超過5.0 mg/mL，Hb峰電流的逐漸降低，可能是由于超過了Co@C-PEI MNPs的負載能力(圖8B)。因此在本實驗中Hb/Co@C-PEI修飾液中Co@C-PEI MNPs的濃度為3.0 mg/mL，Hb濃度為5.0 mg/mL。根據SPE工作電極的實際面積及修飾液的干燥時間，選擇Hb/Co@C-PEI的修飾量為5 μL。

2.6 Hb/Co@C-PEI/SPE對H2O2的檢測

2.6.1 循環伏安行為在溶液中加入H2O2后，觀察Hb/Co@C-PEI/SPE對H2O2電催化還原的CV響應(圖9)，Hb的還原峰電流電流增加，氧化峰電流減小。隨著H2O2濃度的增高，還原峰增加的越明顯，為典型的電催化還原H2O2的過程。

2.6.2 H2O2線性、檢測限及干擾實驗采用電流-時間曲線(i-t)，在恒定電位-0.46 V檢測Hb/Co@C-PEI/SPE對H2O2的響應(圖10)。在3.0×10-6～6.0×10-3mol/L濃度范圍內，還原峰電流Ip與H2O2的濃度c呈線性關系，線性方程為:Ip=0.024c+5.4146(R=0.995)，檢測限(S/N=3)為1.37×10-6mol/L。

圖9 Hb/Co@C-PEI/SPE在含不同濃度H2O2的PBS中的CV曲線(a→c：0.00，3.0×10-6 mol/L，3.0×10-5 mol/L，掃速:100 mV/s)Fig.9 CV curves for Hb/Co@C-PEI/SPE in 0.1 mol/L PBS containing different concentrations of H2O2(a→c:0.00,3.0×10-6 mol/L,3.0×10-5 mol/L,scan rate:100 mV/s)

圖10 Hb/Co@C-PEI/SPE對逐漸加入的H2O2的i -t 曲線(H2O2:3.0×10-6～6.0×10-3 mol/L，工作電位為-0.46 V)Fig.10 Amperometric i -t curve of Hb/Co@C-PEI/SPE at applied potential of -0.46 V upon successive additions of H2O2 in PBS(H2O2:3.0×10-6～6.0×10-3 mol/L)

采用i-t曲線，在電位-0.46 V對一些常見物質進行干擾實驗。在H2O2為6.0×10-6mol/L條件下，金屬離子如Na+、K+、Ca2+、Mg2+(濃度為6.0×10-6mol/L)；有機物如葡萄糖、抗壞血酸、多巴胺和尿酸(濃度為6.0×10-6mol/L)對H2O2的測定基本不產生影響。

2.6.3 Hb/Co@C-PEI/SPE的穩定性和重現性隨機抽取5片Hb/Co@C-PEI/SPE，測定6.0×10-6mol/L 的H2O2，相對標準偏差(RSD)為6.67%。將制備好的Hb/Co@C-PEI/SPE置于4 ℃干燥保存，兩周后進行測定，H2O2的測定基本不受影響(誤差<5%)，表明Hb/Co@C-PEI/SPE具有較好的穩定性。

3 結論

本實驗制備了Co@C-PEI MNPs，在外加磁場的作用下固定Hb，實驗結果表明，Co@C-PEI MNPs具有良好的分散性、導電性與生物相容性，Hb在Co@C-PEI MNPs中能保持其活性，表現出良好的電化學行為。Hb/Co@C-PEI/SPE配合自制的電化學反應池，實現了Hb活性中心與電極之間的直接電子傳遞，電催化H2O2的還原。Co@C-PEI MNPs為生物材料的固載及生物傳感器的構建提供了新方法，與自制傳感器的組合易于制成便攜式設備，有望成為臨床檢測的有效工具。