冶金模式微生物Acidithiobacillus ferrooxidans表面質子吸附特性的研究

周姍， 栗樹珍， 鐘慧， 賀治國

1.中南大學 資源加工與生物工程學院, 生物冶金教育部重點實驗室, 湖南 長沙 410083;

2.中南大學 生命科學學院，湖南 長沙 410013

引 言

A.ferrooxidans是一種革蘭氏陰性、嗜酸、自養型細菌，能夠利用氧作為電子受體，將亞鐵氧化為三價鐵，或將單質硫/還原性無機硫化合物氧化為硫酸鹽而獲得生長所需的能量[1]。這種特殊的代謝特征使其成為酸性礦山廢水(Acid mine drainage)形成和金屬硫化礦生物浸出生產中的關鍵微生物之一[1]，被作為生物冶金模式微生物[2,3]。A.ferrooxidans細胞表面的酸堿性質在其與金屬硫化礦的黏附、對金屬硫化礦的氧化以及對酸性礦山廢水中重金屬離子的吸附方面起著至關重要的作用。

近年來，通過細胞在礦物表面的吸附行為研究對A.ferrooxidans細胞的表面性質有了一定了解[4-6]，如Zhu等人研究發現S0、Fe2+或CuFeS2培養的A.ferrooxidans表面疏水性、凈電荷及與黃銅礦間的吸附力不同，從而對黃銅礦中銅的浸出效率也不同[5]，Li等人研究發現細胞表面的胞外多聚物(EPS)決定著細胞的表面性質，從而決定了A.ferrooxidans細胞在黃銅礦表面的吸附行為[6]。找出不同培養條件及離子強度如何影響A.ferrooxidans細胞的表面特性，將有助于闡明A.ferrooxidans細胞對酸性礦山廢水中重金屬吸附和遷移的影響，并通過改變細胞表面性質提高A.ferrooxidans對金屬硫化礦的浸出效率，然而目前相關研究仍然缺乏。

模擬細菌細胞壁表面的質子模型，對理解細菌表面發生的反應和物質傳輸有重要作用[8]。目前已有許多針對細菌細胞壁質子化反應的電位滴定研究，但是基于這些電位滴定試驗結果的建模方法又不盡相同。例如，Plette[9]等整合了3個位點的Langmuir-freundlich模型和gibbs-donnan shell模型，來模擬RhodococcuserythropolisA177的酸堿滴定結果。Fein[10]等對Bacillussubtilis進行了電位滴定，并且把細胞壁分為三個獨立功能組，然后利用恒定電容模型模擬三組的電位變化，Cox[11]等做了相似的試驗，但是用了一種不同的建模方法，即非靜電線性編程方法，利用5個獨立的結合位點模擬滴定結果。而Martinez[12]等利用Gibbs-donnan shell模型并兼顧一系列均衡分布的pKa值模擬了Bacillussubtilis和Escherichiacoli的滴定結果，并且找到了證據支持可以把細菌表面分為四個功能區。盡管已有大量工作研究其它微生物的表面化學特性[9-14]，以完善表面絡合模型，用于解釋和預測微生物在各種條件下的質子/重金屬吸附行為，目前還沒有研究系統地報道過極端嗜酸菌A.ferrooxidans的表面質子吸附/解吸附規律。細菌表面官能團種類繁多，位點復雜，研究表明細菌表面上最常見的有機酸官能團是羧基、羥基和磷?；?，氨基和巰基的含量較小，整合太少位點的表面絡合模型不能很好地進行擬合[15]。Borrok等人將四位點、無靜電吸附的表面絡合模型作為通用模型對超過35個菌種/細菌群落的225個滴定數據集進行了擬合，之后，Turner和Fein發現盡管四位點的無靜電吸附模型可以合理地描述滴定數據，但獲得的菌的緩沖值 “峰值”比預期要寬[16]。相對于四位點的無靜電吸附模型，三位點的固定電容模型比較適合對細菌表面質子化擬合[13,16]。He等的研究也發現對于嗜酸菌Acidianusmanzaensis的表面質子化擬合，三位點的Donnan殼模型適用，兩位點模型不能夠提供很好的擬合，四位點模型也沒有提升擬合度[17]。該研究中即采用三位點模型，使用被很多研究采用的能夠優化表面質子化模型的ProtoFit[16]來進行酸堿滴定數據擬合，對A.ferrooxidans進行表面質子化模擬。ProtoFit作為一種質子化模型的工具，它可以用表面離散模型(DLM)、固定電容模型(CCM)、Donnan殼模型(DSM)和無靜電吸附模型(NEM)四種表面絡合模型中的一種來對1-4種表面功能基團位點進行優化擬合從而得出該位點的pKa和位點濃度[18]。

該研究中，考察了pH值、離子強度和培養能源(S0、Fe2+、FeS2)對A.ferrooxidans細胞的表面酸堿性質的影響。先后進行了酸堿滴定和ProtoFit質子模擬，并通過電泳遷移率測量和傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法(ATR-FTIR)評估細胞壁上的電荷密度和官能團分布。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

試驗用到的主要儀器設備有雷磁ZDJ-5自動電位滴定儀(上海精密儀器儀表有限公司)、Avanti J-E離心機(Beckman Coulter, Inc.)、PHS-3C pH計(上?？祪x儀器有限公司)、Nicolet Model Nexus 670 傅里葉紅外光譜儀(美國尼高力公司)、YXQ-LS-SII立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、XMTE-7000數控恒溫浴鍋(余姚市長江溫度儀表廠)。

試驗菌株為AcidithiobacillusferrooxidansA9，采用改進的9K基礎培養基培養。培養基配方為：(NH4)2SO43 g，KCl 0.1 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Ca(NO3)20.01 g，加蒸餾水1 000 mL。培養基的初始pH值用H2SO4調節至2.0，分裝于錐形瓶中，120 ℃滅菌20 min。添加S0(10 g/L)、FeSO4·7H2O(44.7 g/L)或者黃鐵礦(2%)作為生長的能源物質，S0和FeSO4·7H2O等藥品均為分析純(AR)，由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司生產。將接種了A.ferrooxidans的錐形瓶置于30 ℃、180～200 r/min的恒溫搖床培養。

試驗用黃鐵礦(FeS2)由生物冶金教育部重點實驗室提供，粒度≤0.074 mm。經測定，黃鐵礦礦樣中元素Fe的質量百分比為44.46%，S為47.78%。X射線衍射物相分析(結果見圖1)結果表明礦樣可作為純礦物使用，雜質為石英。

圖1 黃鐵礦X射線衍射圖

1.2 試驗方法

當細菌長到穩定期時，10 000 r/min離心15 min收集菌體。收集的菌體懸浮于0.001 mol/L、0.01 mol/L或0.1 mol/L的背景電解質NaNO3溶液中，在25 ℃進行電位滴定試驗。滴定前，用純度大于99.99%的氮氣滌蕩0.5 h以趕走溶液中的二氧化碳，使pH值保持在4～5之間。電位滴定試驗按照文獻報道的方法[15]進行，菌懸液先用0.1 mol/L HNO3溶液調整pH值至2.0，然后用0.01 mol/L NaOH在電位漂移率≤5 mV/min(0.1 mV/Sec)時持續加入堿，滴定至pH值為10。為了檢測可逆性和質子化行為進行了逆向滴定，即在到達滴定終點(pH值為10)后，用0.1 mol/L HNO3溶液迅速滴定到pH值為2，記錄過程中所用HNO3溶液的體積。整個滴定過程保持較低壓力的氮氣緩慢地通入菌懸液。滴定結束后，對酸堿滴定結果進行擬合。利用ProtoFit軟件將原始滴定數據進行優化處理，得到最優化模擬數據，根據最優數據模擬出質子模型，并與原始滴定數據作比較以檢驗將質子模型應用于極端嗜酸微生物A.ferrooxidans表面酸堿性質研究的適用性。

為了進行電泳遷移率測量，菌體離心收集、洗滌后重懸于0.001 mol/L、0.01 mol/L或0.1 mol/L的NaNO3溶液中，保存在冰上。將三個不同離子濃度的NaNO3溶液的等分試樣(10 mL)通過分別添加1 mol/L HNO3溶液或1 mol/L NaOH溶液，調整為不同的pH值(2～10)。在電泳遷移率測量之前，將這些樣品和相應離子強度的細菌懸浮液混合，并測定最終pH值。使用Zeta電位和粒度分析儀(Delsa 440SX)在25 ℃下測量電泳遷移率。所有試驗均設置三個平行。

FTIR分析：配制不同pH值的0.01 mol/L的NaNO3溶液制備細菌懸液，利用FTIR分光光度計測定吸光值[18]。每一個pH值條件下，在4 000 cm-1～950 cm-1波長范圍內，以4 cm-1的分辨率進行100次測定。

2 試驗結果

2.1 不同能源培養的A. ferrooxidans不同離子強度酸堿滴定曲線

電位滴定曲線見圖2(a-c)，結果表明，三種不同能源培養的A.ferrooxidans在pH值2～4間均有很強的緩沖能力。一些研究發現去質子化過程就是細菌表面的酸性位點對溶液中不斷加入的堿性溶液的一種緩沖現象[17,19]，在該研究中得到了相同的結論。滴定過程中滴定儀實時顯示的滴定曲線表明細菌懸浮液的第一次pH值升高和第二次pH值降低的滴定之間具有極好的一致性(圖片未展示)，表明在滴定試驗的時間范圍內(約2 h)，質子吸附和解吸是完全可逆的。每種離子強度下，質子在細菌上的吸附程度隨pH值的增加而降低。滴定數據還表明，培養能源對細菌的緩沖能力有很大的影響。整體上，以S0為能源培養的A.ferrooxidans具有最強的緩沖能力，以Fe2+為能源的次之，而FeS2培養的最弱。在Li等人的研究中，在0.01 M NaCl溶液作為背景電解質的離子強度下，Fe2+為能源培養的A.ferrooxidans的緩沖能力也低于以S0為能源的，但以CuFeS2為能源的緩沖能力最強[6]。離子強度對不同能源培養的A.ferrooxidans細胞的緩沖能力表現出不同的影響。S0培養的A.ferrooxidans在0.1 mol/L的NaNO3溶液中緩沖能力最好，當0.01 mol/L NaOH用量為110 mL時，滴定曲線才基本平衡。FeS2為能源培養的A.ferrooxidans在0.001 mol/L的NaNO3溶液中緩沖能力最好，NaOH用量為42 mL時滴定趨于平衡。而A.ferrooxidans以Fe2+為能源培養后對0.01 mol/L NaNO3溶液緩沖能力好，NaOH用量在53 mL左右時去質子化基本達到平衡。

圖2 S0(a)、Fe2+(b)、FeS2(c)培養的A. ferrooxidans不同離子強度酸堿滴定曲線

測量的pH值(x軸)與在滴定過程中消耗或釋放的質子(y軸)相對于離子強度的歸一化結果如圖3所示，便于直觀比較不同離子強度下的結果?？v坐標數據根據公式(1)進行計算：

圖3 S0(a)、Fe2+(b)、FeS2(c)培養的A. ferrooxidans不同離子強度質子吸附/解吸附結果

[H+]consumed/released=(Ca-Cb-[H+]+[OH-])/mb

(1)

其中Ca和Cb是滴定過程添加的酸和堿的濃度，單位為mol/L，mb是細菌的濕重懸浮液濃度(g/L)。

質子吸附/解吸附曲線表明不同能源培養的A.ferrooxidans細胞的表面存在pKa值相近的官能團，且在所研究的整個pH值范圍內發生了大量的質子吸附/解吸附。在三種不同的離子強度溶液中，三種不同能源培養的細胞呈現出明顯不同的位點濃度。在0.01 mol/L電解質溶液中，以Fe2+為能源培養的A.ferrooxidans細胞的位點濃度是以S0為能源條件下的兩倍，是FeS2為能源條件下五倍。對于以S0為能源培養的A.ferrooxidans，在0.01 mol/L電解質溶液中的總位點濃度明顯低于在另外兩個研究的離子強度下的，而以Fe2+為能源的在0.01 mol/L離子強度的電解質溶液中總位點濃度最高。以FeS2為能源培養的A.ferrooxidans細胞在三種離子強度下總位點濃度無顯著差異。

之前的研究報道表明[17]，嗜酸嗜熱古菌A. manzaensis在0.01 mol/L的NaNO3溶液中能緩沖大量的NaOH，在滴定達到平衡的時候NaOH的用量達到50 mL；在0.001 mol/L的NaNO3溶液中NaOH用量為47 mL；而在0.1 mol/L NaNO3溶液中其緩沖能力最差，只消耗35 mL 0.01 mol/L的NaOH溶液即基本達到平衡。Tourney等[20]研究了革蘭氏陽性嗜熱菌Bacillus licheniformis S-86的電位滴定，發現在所研究的范圍內，離子強度對去質子化常數或位點濃度沒有顯著影響。而Burnett等[18]得出結論，隨著離子強度的增加，Anoxybacillus flavithermus的緩沖能力增加。Johnson[21]的研究表明，革蘭氏陰性細菌Shewanella putrefaciens在好氧和厭氧條件下表現出完全不同的酸堿性質，這些差異遠大于不同培養基配方或菌齡引起的差異。但是，該研究中生長能源(S0、Fe2+、 FeS2)顯著影響了A.ferrooxidans的表面特性，導致離子強度對不同能源培養的A.ferrooxidans細胞表面緩沖能力的影響也不同。

2.2 ProtoFit模擬

該研究采用DSM(Donnan殼的靜電模型)來模擬不同離子強度條件的滴定，利用每組滴定數據計算出不同能源培養的A.ferrooxidans細胞表面位點的logK值和位點濃度(表 1)。

表1 不同能源培養的A. ferrooxidans及一些生物表面的表面特性

根據文獻[11,12,25]，羧基的解離常數為2～6，磷酸鹽基團的解離常數一般為5.6～7.2，伯胺的解離常數大于10，氨基的解離常數為7～9，羥基的解離常數為8.6～9。該研究中，根據ProtoFit軟件模擬得到的去質子化常數可以推測A.ferrooxidans細胞表面存在羧基、磷酸鹽基團和伯胺。

圖4 S0(a)、Fe2+(b)、FeS2(c)培養的A. ferrooxidans不同離子強度電泳遷移率

2.3 電泳遷移率分析

電泳遷移率可以估算出整個細菌表面電荷及其等電點，圖3為不同能源培養的A.ferrooxidans在不同離子強度下的電泳遷移率。數據表明，A.ferrooxidans在pH值范圍內(2～10)均呈負電性。隨著pH值的升高，A.ferrooxidans表面的負電荷增加，符合微生物表面帶電的一般特性[26]。有研究報道電泳遷移率隨離子強度的增加而降低[27]，但該研究的結果并不支持這一結論。目前關于離子強度對細菌質子化參數影響的研究尚未達成共識[20]。該研究中觀察到細胞的電泳遷移率取決于許多因素，例如pH值、離子強度和培養能源，并且發現培養能源極大地影響了細菌的電泳遷移率。對于以S0或Fe2+為能源培養的A.ferrooxidans細胞，pH值對電泳遷移率的影響隨離子強度的增加而增加(斜率變陡)，而對于以FeS2為能源培養的A.ferrooxidans細胞，該研究中得到了相反的結論。結果還表明，培養能源顯著影響A.ferrooxidans細胞的等電點。以S0為能源培養的A.ferrooxidans的等電點(IEP)約為2.0，并且不受溶液離子強度的影響。對于以Fe2+或FeS2為能源培養的A.ferrooxidans，即使在研究的最低pH值下也未觀察到IEP。

2.4 A. ferrooxidans的ATR-FTIR圖譜分析

進一步采用ATR-FTIR分析在不同的pH值條件下，不同能源培養的A.ferrooxidans表面官能團的分布規律。圖5是以S0、Fe2+或FeS2為能源培養的A.ferrooxidans在pH值為2.02、4.04、5.66、7.97和9.7條件下的ATR-FTIR圖譜。表2總結了在不同pH值下以S0、Fe2+或FeS2為能源培養的A.ferrooxidans的主要官能團的特征峰的比較。結果表明，A.ferrooxidans的紅外圖譜顯示出較大的差異，與培養能源和pH值相關。

表2 不同pH值下以S0、Fe2+或FeS2為能源培養的A. ferrooxidans表面主要官能團的比較

以S0為能源培養的A.ferrooxidans，pH值為4.04、5.66和7.92時的吸收峰較多，主要分布在1 000 cm-1～1 200 cm-1和1 500 cm-1～1 700 cm-1范圍內，pH 值為2.01和pH值為9.7時的圖譜沒有明顯的吸收峰。1 044 cm-1處的吸收峰在pH值為2.01時比較弱，與1 083 cm-1處的吸收峰強度幾乎一樣。之后隨著溶液堿性增加，1 044 cm-1處的吸收慢慢增強，在pH值為7.92時的譜帶中達到最大，是1 083 cm-1處的吸收峰的5倍以上。但是，在pH值為9.7時的譜帶中沒有這兩個吸收峰。1 500 cm-1～1 600 cm-1范圍內各pH值條件下的譜帶也有明顯區別：在pH值為2.01時的譜帶中，這個范圍的吸收峰較弱；在pH值為4.04和5.66的譜帶中，這個范圍的吸收峰寬度和強度都很相似。pH 值為7.92的譜帶中，1 630 cm-1處的吸收峰變得很強，主要是由氨基與蛋白連接的C=O基團的伸縮引起的特征吸收峰。酰胺Ⅱ類和酰胺Ⅰ類的吸收峰分別出現在1 538 cm-1、1 546 cm-1和1 630 cm-1處，酰胺Ⅱ類與酰胺Ⅰ類的比值隨著pH值的上升而增大，但是在pH值為9.7時兩個吸收峰不明顯。

以Fe2+為能源培養的A.ferrooxidans的ATR-FTIR圖譜見圖5 (b)。仲醇C-O基團的吸收峰隨著pH值的上升位置有所偏移，從pH值為2.01的1 072 cm-1，到pH值為5.66時的1 080 cm-1，到pH值為7.92時的1 084 cm-1；而且在pH值≥4.04時，逐漸分出伯醇C=O基團的吸收峰，在pH值為7.92時仲醇C-O基團和伯醇C=O基團的吸收峰最強。1 650 cm-1～1 550 cm-1為酰胺Ⅰ類和酰胺Ⅱ類的吸收峰。酰胺Ⅱ類的吸收隨pH值的上升而減弱，酰胺Ⅰ類的吸收隨pH值的上升而增強。酰胺Ⅰ類與酰胺Ⅱ類在pH值為9.7時吸收峰不明顯。

圖5 S0(a)、Fe2+(b)和FeS2(c)培養的A. ferrooxidans在不同pH值的ATR-FTIR圖譜

圖5(c)是以FeS2為能源培養的A.ferrooxidans的ATR-FTIR譜圖。吸收峰主要集中在1 260 cm-1～1 000 cm-1和1 640 cm-1～1 600 cm-1兩個波段。1 260 cm-1～1 000 cm-1被復雜的疊加振動所控制，主要為C-O-C和C-O-P的伸縮振動，這些基團涉及復雜的多糖群體。pH值為4.04和7.92的譜帶中沒有較強的吸收峰。1 084 cm-1的吸收峰隨pH值的上升其吸收減弱，而且吸收波段有所遷移，pH值為9.7時在1 077 cm-1。酰胺Ⅱ類和酰胺Ⅰ類的吸收峰分別出現在1 547 cm-1、1 545 cm-1和1 646 cm-1處。酰胺Ⅱ類與酰胺Ⅰ類的比值隨著pH值的上升而減弱，但是在pH值為9.7時酰胺Ⅱ類吸收峰明顯。相對以S0或Fe2+為能源培養的A.ferrooxidans的譜圖，以FeS2為能源培養的A.ferrooxidans的譜圖吸收峰較多，沒有像以S0或Fe2+為能源培養的A.ferrooxidans的譜圖一樣出現明顯的特征吸收峰。

這些有酸堿活性的羧基、酰胺基和磷酸基等官能團在電位滴定過程中起到重要的作用，不同能源培養的A.ferrooxidans表面官能團分布的差異影響了其質子吸附/解吸附規律。

3 結論

該研究將酸堿電位滴定結合表面絡合理論用于極端嗜酸菌A.ferrooxidans的酸堿緩沖能力的解析。結果表明，A.ferrooxidans的表面性質受到能源、離子強度和pH值的影響。隨著pH值的升高，緩沖容量也增加，導致表面負電荷增加。ProtoFit擬合結果表明以S0為能源培養的A.ferrooxidans表面的總位點濃度高于以Fe2+或FeS2為能源培養的A.ferrooxidans。根據選擇的DSM模型，可以通過調用三種不同類型的細胞壁官能團來表征A.ferrooxidans細胞壁的酸堿性質：羧基、磷酸基和酰胺基，并通過ATR-FTIR得到了驗證。與S0為能源培養的A.ferrooxidans相比，以FeS2為能源培養的A.ferrooxidans的表面官能團具有更高的多樣性。該研究將表面絡合理論擴展到冶金模式微生物A.ferrooxidans，結果同樣適用，該研究可以為A.ferrooxidans及其它嗜酸微生物的表面性質的研究提供重要參考。