UPLC 法同時測定小兒咳喘靈顆粒中5 種成分

錢葉飛 陸林玲 張華鋒 周 堅

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心， 江蘇 蘇州215104）

小兒咳喘靈顆粒是由金銀花、麻黃、板藍根、甘草、苦杏仁、石膏、瓜蔞7 味藥材組成的中藥復方制劑，具有止咳祛痰、宣肺清熱的功效，臨床上廣泛用于治療上呼吸道感染及其引起的咳嗽等病癥，是兒科常用中成藥之一［1-4］，但其現行質量標準中僅檢測綠原酸或鹽酸麻黃堿單一成分的含有量［5-6］，過于簡單，而且方法也不統一。目前，大多數文獻［7-11］采用HPLC 法分析小兒咳喘靈顆粒中主要成分，為了節約時間與成本，加快檢驗進度，本實驗建立UPLC 法同時測定其中板藍根活性成分（R，S）-告依春、金銀花活性成分綠原酸、苦杏仁活性成分苦杏仁苷、甘草活性成分甘草苷和甘草酸的含有量，以期為該制劑質量標準提高提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class UPLC 超高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器（PDA）、Empower 3化學工作站（美國Waters 公司）；電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Millipore Synergy超純水機（美國密理博公司）。

1.2 試劑與藥物（R，S）-告依春、甘草苷、苦杏仁苷、綠原酸（批號分別為111753-201706、111610-201607、110820-201607、110753-201716，純度分別為93.1%、90.7%、99.3%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；甘草酸（批號MUST-17060805，純度99.65%）對照品購于成都曼思特生物科技有限公司。36 批小兒咳喘靈顆粒來自全國11個廠家。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長207 nm（苦杏仁苷）、237 nm［（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸］；進樣量1 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱?。≧，S）-告依春、甘草酸、甘草苷、苦杏仁苷、綠原酸對照品10.83、9.27、10.88、11.80、10.07 mg，置 于10 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，作為貯備液（質量濃度分別為1.083 0、0.923 8、1.012 9、1.070 3、1.000 0 mg/mL）。各精密吸取2 mL，置于20 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得（質量濃度分別為108.300 0、99.995 1、92.375 6、101.292 8、107.026 0 μg/mL）。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2.2 供試品溶液 取顆粒適量，研磨成細粉后精密稱取2.0 g，置于20 mL 量瓶中，加入15 mL 50%甲醇超聲（250 W、33 kHz）處理30 min，放冷至室溫，50%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照顆粒處方比例和制備工藝，分別制備缺板藍根、缺苦杏仁、缺甘草、缺金銀花的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各1 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度理想，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液（批號170908），在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷峰面積RSD 分別為0.63%、0.55%、0.07%、0.79%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液（批號170908），于0、6、12、18、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷峰面積RSD分別為2.37%、1.78%、0.64%、1.86%、2.29%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.l UPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 重復性試驗 精密稱取同一批顆粒（批號170908）6 份，按“2.2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷峰面積RSD 分別為0.47%、0.98%、0.14%、0.95%、0.24%，表明該方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取各成分含有量已知的同一批顆粒（批號170908）6 份，每份約1 g，精密稱定，精密加入適量對照品溶液，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表3。

2.9 耐用性試驗 本實驗考察了Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Waters Acquity HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，發現各成分均能達到比較理想的分離效果，表明該方法耐用性良好。

2.10 樣品含有量測定 取11 個廠家生產的36 批樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表4。

3 討論

3.1 檢測指標篩選 麻黃為小兒咳喘靈顆粒君藥，對制劑宣肺止咳的功效發揮著關鍵作用，但其主要成分麻黃堿和偽麻黃堿具有揮發性，提取方法與其他成分不同，而且普通的C18色譜柱對兩者分離效果不佳［12-13］，故今后課題組將對相關質量評價方法進行改進。另外，方中石膏、瓜蔞主要成分尚不明確，也未納入研究。因此，本實驗選擇板藍根、苦杏仁、甘草、金銀花所含主要成分作為檢測指標。

3.2 檢測波長篩選 本實驗采用二極管陣列檢測器在200～400 nm 波長處進行掃描，并結合2015年版《中國藥典》，以物質吸收大小和與其他色譜峰分離度為指標，最終確定為207、237 nm 雙波長檢測。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

表4 各成分含有量測定結果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg/g）

3.3 供試品溶液提取方法篩選 根據文獻［14］報道，本實驗考察了提取溶劑30% 甲醇、50% 甲醇、70%甲醇，溶劑用量10、20、30、50 mL，提取時間15、30、45 min 對各成分提取效果的影響。最終確定，最優供試品溶液提取方法為20 mL 50%甲醇提取30 min。

3.4 含有量分析 36 批小兒咳喘靈顆粒中（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷最高含有量分別是最低含有量的9.67、60.72、23.22、22.49、88.89 倍。由此可知，不同廠家和同一廠家不同批次生產的樣品中各成分含有量差異均較大，質量參差不齊，可能與藥材產地、采收季節、生產工藝等因素有關，具體原因有待進一步研究。

4 結論

本實驗建立的UPLC 法能在30 min 內同時測定小兒咳喘靈顆粒中（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷的含有量，而且簡便準確，重復性好，可提高檢驗效率，全面評價該制劑質量，從而為完善其質量標準提供依據。