細點圓趾蟹含肉下腳料酶解物中抗氧化肽的分離與鑒定

余 輝 陳小娥 曾茂茂 何志勇 張 爽 方旭波 陳 潔*

（1 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室 江蘇無錫214122 2 浙江海洋大學食品與醫藥學院 浙江舟山316022）

近年來，隨著海洋資源的衰退與快餐業的高速發展，新的蛋白質資源開發迫在眉睫，低值細點圓趾蟹（Ovalipes punctatus）開發利用逐漸進入水產加工者的視野。細點圓趾蟹經蒸煮，人工挑取蟹螯和頭胸部的大塊蟹肉，再加工成冷凍蟹肉罐頭和蟹肉糜[1]。由于細點圓趾蟹具有個頭小、肌肉組織松散等特點，所以加工過程中產生許多含肉下腳料，包括蟹螯、頭胸部和腹部殘留蟹肉以及難以加工的附肢和小蟹等。這些下腳料中殘留的蟹肉若不回收利用，不僅嚴重浪費蛋白質資源，而且也會污染環境。如何回收利用這些殘留的蟹肉，是當前加工企業急需解決的問題。

目前，從蟹下腳料中回收殘留的蟹肉有2種方法：一種是機械擠壓與離心分離的方法[2]，該方法獲得的蟹肉具有顏色灰暗、有碎蟹殼等缺點，使其市場化應用受到一定的限制；另一種是提取/水解蛋白回收方法，該方法是當前研究的熱點，如絲氨酸膠原蛋白酶的提取[3]，蛋白水解回收[4-6]，抗菌肽[7-9]，抗腫瘤肽[10]以及抗氧化肽的酶法制備[11]。然而，有關細點圓趾蟹下腳料的利用研究很少，僅有李晶等[12]采用酶法制備海鮮調味基料的報道。盡管胡小超等[13]利用細點圓趾蟹肉制備金屬鋅螯合肽，以鋅的螯合率為指標，通過正交試驗優化獲得最適酶解工藝，但其目的是采用蟹肉制備新型生物態鋅，而非對下腳料進行綜合利用，更未對細點圓趾蟹金屬鋅螯合肽進行分離純化與結構鑒定。

多肽結構與其活性有著密切關系，明確多肽的氨基酸組成對揭示其構效關系有著重要的意義[14-15]。本研究擬采用胰蛋白酶水解細點圓趾蟹含肉下腳料制備抗氧化肽，通過超濾、離子交換和凝膠層析初步分離純化，并利用半制備型RP-HPLC進一步純化，采用超高效液相色譜-電噴霧飛行時間串聯質譜（UPLC-ESI-TOF-MS/MS）鑒定其結構，最后通過合成多肽進一步驗證其抗氧化性，旨在為細點圓趾蟹含肉下腳料的抗氧化肽開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細點圓趾蟹含肉下腳料（OPW），舟山市常青海洋食品公司提供。

胰蛋白酶（2 500 U/mg），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Sephadex G-15 填料，美國GE 公司；HPLC 級乙腈，美國天地公司；L-還原型谷胱甘肽（GSH）和2，2-連氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）銨鹽[2，2′-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt, ABTS]，美國sigma 公司；其它試劑均為分析純級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

板式超濾設備，美國Minipore 公司；MA99-3自動核酸蛋白分離層析儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；Evolution60 紫外可見分光光度計，美國熱電公司；Waters 1525 型半制備液相色譜儀、Waters Synapt 超高壓液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜儀，美國Waters 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 OPW 酶解物（OPWTPs）的制備 蟹下腳料剔除蟹背甲、斬拌，用甲醇：氯仿體積比1∶2 進行脫脂（料液比為0.333 kg OPW/L 混合溶劑），抽濾，濾渣70 ℃干燥5 h。濾渣粉碎后，按料液比為0.2 kg OPW 干基/L 純水、加酶量為4 000 U/g OPW 干基、溫度50 ℃、pH 7.5 的條件水解3 h。待反應結束后，12 000×g 離心20 min，上清液真空濃縮至原體積的1/3，凍干后即為OPWTPs。

1.3.2 抗氧化肽的分離與鑒定

1.3.2.1 超濾 OPWTPs 溶于超純水中制成粗肽溶液（500 mg/mL），12 000×g 離心5 min，上清液依次通過3種超濾膜（截留相對分子質量5，3，1 ku）進行分離，分別獲得相對分子質量>5 ku、3～5 ku、1～3 ku、<1 ku 的4 個肽段，其中<1 ku 的肽段經Hitrap Desalting 預裝柱脫鹽。真空濃縮后冷凍干燥，測其各肽段的ABTS+·清除率。

1.3.2.2 凝膠過濾層析 上述抗氧化活性最高的肽段溶于超純水中制成多肽溶液（100 mg/mL），12 000 ×g 離心5 min，上清液采用已平衡的Sephadex G-15 凝膠柱（?1.6 cm×120 cm）進行分離純化。柱層析條件：上樣量20 mL、流速1 mL/min、洗脫液為超純水，分步收集，2 mL/管，每隔1 管在波長220 nm 下測其吸光值，收集洗脫峰。多次重復上樣，合并收集各洗脫峰，真空濃縮凍干后測其各洗脫峰的ABTS+·清除率并計算IC50值。

1.3.2.3 RP-HPLC 制備色譜 上述抗氧化活性最高的肽段溶于超純水中制成多肽溶液（10 mg/mL），12 000×g 離心5 min，上清液用RPHPLC 制備色譜進行分離純化。色譜條件：SunfireTMPre C18制備柱（?19 mm×250 mm，5 μm），檢測波長214 nm，柱溫25 ℃，流動相為乙腈和水，流速6 mL/min，上樣量0.5 mL；梯度洗脫模式，30 min 內乙腈體積分數從0%升至50%。多次重復分離，合并收集各洗脫峰，真空濃縮凍干后測其各洗脫峰ABTS+·清除率。

1.3.2.4 UPLC-ESI-TOF-MS/MS 結構鑒定 上述抗氧化活性最高的洗脫峰溶于超純水中制成多肽溶液（1 mg/mL），12 000 ×g 離心5 min，上清液中多肽采用UPLC-TOF-MS/MS 進行結構分析。液相色譜條件：Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（?2.1 mm×120 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸溶液和乙腈，流速為0.3 mL/min，梯度洗脫，20 min 內乙腈含量由0 變到20%。質譜條件：ESI 電離源，毛細管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為30 V，離子源溫度為100 ℃。多肽結構通過MassLynx 軟件中Protein/Peptide sequence 程序進行分析。

1.3.2.5 多肽合成及活性測定 以獲得的抗氧化肽為目標肽，委托吉爾生化（上海）有限公司采用固相合成方法進行合成，并對脫鹽合成肽的純度與一級結構進行分析。同時測定合成肽和GSH 溶液的ABTS+·清除率。

1.3.2.6 多肽含量及ABTS+·清除率的測定 多肽含量測定按照余冰賓[16]的Folin-酚試劑法方法測定。ABTS+·清除率按照Zhu等[17]的方法測定，ABTS+·清除率（%）=（Ab-As）/Ab×100，式中Ab為空白樣吸光值，As為樣品吸光值。IC50值為ABTS+·清除率達50%的多肽溶液質量濃度，單位為mg/mL。

2 結果與分析

2.1 超濾分離

目前，大部分抗氧化肽的分子質量在500～1 800 u 范圍內[18]，因此本文采用1，3，5 ku 的超濾膜對OPWTPs 進行分離，獲得了4 個組分（圖1），分別為OPWTPs-Ⅰ（分子質量>5 ku），OPWTPs-Ⅱ（3～5 ku），OPWTPs-Ⅲ（1～3 ku）和OPWTPs-Ⅳ（<1 ku）的肽段，且OPWTPs，OPWTPs-Ⅰ，OPWTPs-Ⅱ，OPWTPs-Ⅲ和OPWTPs-Ⅳ的清除ABTS+·的IC50值分別為2.47，10.21，36.16，3.36 和1.43 mg/mL。其中，OPWTPs-Ⅳ肽段清除ABTS+·能力比其它3 個肽段強，表明OPWTPs-Ⅳ肽段中含有更多ABTS+·清除能力強的抗氧化肽，與鰹魚籽和褐牙鲆肌肉酶解液中低分子質量的肽段具有最高抗氧化活性的結論相似[19-20]。因此，推斷OPWTPs-Ⅳ肽段含有高ABTS+·清除率的小分子質量的多肽。

圖1 超濾組分ABTS+·清除率Fig.1 ABTS+·scavenging rates of ultrafiltration fractions

圖2 OPWTPs-Ⅳ組分的Sephadex G-15 凝膠柱層析曲線（a）及各分離峰的ABTS+·清除率（b）Fig.2 Column chromatogram of fraction OPWTPs-Ⅳon Sephadex G-15（a）and ABTS+·scavenging rates of separate peaks（b）

2.2 Sephadex G-15 分離

凝膠排阻色譜是一種根據分子大小分離生物活性物質的有效方法[21-22]。從圖2可看出，OPWTPs-Ⅳ經Sephadex G-15 分離得到3 個組分，分別命名為P1，P2 和P3，且其IC50值分別為4.02，1.39 和1.90 mg/mL，表明分子質量小的多肽確實具有較高的ABTS+·清除能力，與Yan等[23]的結果相似。因此，P2 組分含有高ABTS+·清除率的小肽。

2.3 半制備型RP-HPLC 分離

圖3 表明，P2 組分經RP-HPLC 分離后其分離度較好且分離出7 個組分，依次命名為P2-1，P2-2，P2-3，P2-4，P2-5，P2-6 和P2-7。由圖可知，在1 mg/mL 時，只有P2-3 和P2-5 組分的ABTS+·清除率均在90%以上，且其IC50值分別為0.488 mg/mL 和0.201 mg/mL，而其它組分的ABTS+·清除率均低于40%以下，表明多肽抗氧能力不僅與其疏水性有關[24]，更與其氨基酸的組成和肽的序列有關[25-26]。

圖3 P2 組分的半制備型RP-HPLC 的色譜圖（a）及各分離峰的ABTS+·清除率（b）Fig.3 Semi-preparative RP-HPLC chromatogram of fraction P2 on C18 preparative column（a）and ABTS+·scavenging rates of separate peaks（b）

2.4 質譜鑒定結果

UPLC-ESI-TOF-MS/MS 已成功應用于多肽結構鑒定[27]。組分P2-3 和P2-5 經TOF-MS/MS 分析，獲得片段的質荷比（m/z）（圖4 和圖5）。根據肽鍵斷裂過程中形成的bi和yn-i系列離子的信息，采用Masslynx 軟件中Protein/Peptide Editor 程序對獲得的bi和yn-i系列離子的質量碎片進行預測，并與質譜圖上的碎片進行匹配，各獲得1 個可靠性在99%及以上的多肽序列，其氨基酸序列分別為Tyr-Glu-Gly（YEG）和Tyr-Glu（YE）。食源性抗氧化肽通常在N-端含有疏水性的氨基酸殘基，如Pro，His，Tyr，Met 和Cys[18]，本文所獲得的2種小肽均符合上述特征。

圖4 組分P2-3 中主成分的二級質譜圖Fig.4 TOF-MS/MS spectra of main constituent in fraction P2-3

圖5 組分P2-5 中主成分的二級質譜圖Fig.5 TOF-MS/MS spectra of main constituent in fraction P2-5

2.5 多肽合成及活性測定

合成肽YEG 和YE 由吉爾生化（上海）有限公司合成，其純度分別為98.04%和98.52%（圖6和圖7），分子質量分別為367.35 u 和310.30 u（圖8 和圖9）。同時，對合成肽YEG 和YE 以及谷胱甘肽（GSH）的清除ABTS+·的IC50值進行測定（圖10），結果顯示，合成肽YEG 和YE 的清除ABTS+·的IC50值分別0.456 mg/mL 和0.184 mg/mL，且YE 的IC50值比GSH（IC50值為0.264 mg/mL）高出30.30%，與已報道類似小肽的結果相似[28-29]。

圖6 合成肽YEG 的RP-HPLC 色譜圖Fig.6 RP-HPLC chromatogram of synthetic peptides YEG

圖7 合成肽YE 的RP-HPLC 色譜圖Fig.7 RP-HPLC chromatogram of synthetic peptides YE

圖8 合成肽YEG 的質譜圖Fig.8 Mass spectra of synthetic peptides YEG

圖9 合成肽YE 的質譜圖Fig.9 Mass spectra of synthetic peptides YE

圖10 合成肽YEG 和YE 以及GSH清除ABTS+·的IC50 值Fig.10 IC50 values for ABTS+·scavenging of synthetic peptide YEG and YE as well as reduced L-Glutathione

3 結論

本文采用胰蛋白酶對細點圓趾蟹含肉下腳料進行酶解，利用超慮系統、Sephadex G15 和半制備型RP-HPLC 分離純化獲得2 個ABTS+·清除率較高的組分P2-3 和P2-5。應用UPLC-TOF-MS/MS對這2 個組分進行結構鑒定，最終鑒定出2種小肽的氨基酸序列為Tyr-Glu-Gly 和Tyr-Glu。經固相合成，合成肽YEG 和YE 的分子質量分別為310.30 u 和367.35 u，純度分別為98.52%和98.04%。同時，合成肽YEG 和YE 的清除ABTS+·的IC50值分別0.456 mg/mL 和0.184 mg/mL，且YE 的IC50值比GSH 高出30.30%。本研究明確了細點圓趾蟹含肉下腳料酶解產物的抗氧化活性，并對其含有的抗氧化肽進行了分離純化與結構鑒定，為細點圓趾蟹含肉下腳料的開發與利用提供了理論依據。