核桃多肽復配核桃乳對小鼠抗疲勞及抗氧化作用研究

王嘉佳，李曉倩，高山，牟德華*，何愛民，吉洋洋

1(河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊，050018) 2(河北省藥品檢驗研究院，河北 石家莊，050020) 3(河北省核桃產業技術研究院，河北 臨城縣，054300)

核桃，胡桃科植物，又稱羌桃、胡桃。其中含大量優質蛋白，人體必需ω-3脂肪酸，多種微量元素，礦物質以及葉酸 (維生素B)、維生素E、胡蘿卜素、核黃素等多種維生素[1]，營養價值高。核桃粕作為榨油副產物常被用作飼料或丟棄，本實驗從核桃粕中提取核桃蛋白質，并進一步制備核桃多肽，同時選取大豆多肽、核桃蛋白等功能因子加入核桃乳中，制備具有抗氧化、抗疲勞功效的功能性核桃乳。

生物活性肽是一種對機體有益的肽類化合物，通常含有3～20個氨基酸殘基，可以調節生物體的代謝和生理功能，對人體健康十分有益[2]。目前研究發現了抗菌肽[3]、降壓肽[4]、抗氧化肽[5]、抗血栓肽[6]、免疫調節肽[7]、礦物質結合肽[8]、大豆多肽[9]等多種生物活性肽。核桃多肽和大豆多肽均為植物活性多肽，食用安全性高，具有抗疲勞、降血糖、抗氧化、免疫調節等多種生物學功能[10-18]。由于目前核桃多肽、大豆多肽、核桃蛋白等功能因子對小鼠運動耐力影響以及抗疲勞效果通常采用單一的負重游泳實驗來進行分析評價，而其抗氧化活性多以體外實驗為主，缺乏多途徑且完備的分析評價機制，因此對其抗疲勞和抗氧化活性進行深入研究已迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

核桃仁、核桃粕，河北綠嶺果業有限公司；大豆多肽粉(肽含量≥80%)，北京中食海氏生物技術有限公司；堿性蛋白酶(200 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)，上海源葉生物科技有限公司；乳酸測試盒、肝/肌糖原測試盒、尿素氮測試盒(脲酶法)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)測試盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)測試盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測試盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Adventurer分析電子天平，美國奧豪斯儀器有限公司；QI-24高通量組織研磨儀，上海啟前電子科技有限公司；DEL7A320 pH計，上海展儀儀器設備有限公司；EPOCH2全波長酶標儀，美國博騰儀器有限公司方法；H2050R-1型低溫離心機，湖南湘儀儀器有限公司。

1.3 實驗材料

核桃蛋白復配核桃乳、核桃多肽復配核桃乳、大豆多肽復配核桃乳由實驗室制備。為簡化不同種類核桃乳制備工藝，實驗首先制備單一核桃乳，再將核桃蛋白粉、核桃多肽粉及大豆多肽粉分別按一定濃度添加到核桃乳中，均質處理后得到不同種類的核桃乳，制備工藝如下：

核桃乳制備：挑選顆粒飽滿核桃仁50 g，按照料液比1∶20(g∶mL)加入質量分數為0.5% NaOH溶液,煮沸5 min去皮，膠體磨磨漿20 min，過濾后定容至1 L，調節pH至9，高壓均質機均質2次，灌裝到密閉玻璃瓶中，121 ℃滅菌20 min，冷卻后得到核桃乳,備用。

核桃蛋白復配核桃乳制備：將核桃粕放入55 ℃烘箱烘干，按料液比1∶55(g∶mL)配制成核桃粕溶液，調節pH至8.5，50 ℃超聲攪拌60 min，超聲功率為150 W，4 500 r/min離心10 min，去油層及下層沉淀，上清液調節pH值至4.5，4 500 r/min離心10 min取沉淀層，將沉淀用去離子水洗至中性，冷凍干燥后得到核桃蛋白粉。根據GB 5009.5—2016測得核桃蛋白粉蛋白含量為83.15%。將核桃蛋白粉以核桃乳作為溶劑復溶，質量濃度為100 mg/mL，高壓均質后得到核桃蛋白復配核桃乳。

核桃多肽復配核桃乳制備：稱取一定量的核桃蛋白粉，配制成質量分數為2.5%核桃蛋白溶液，60 ℃搖床水浴30 min后，調節pH至7.5，按質量比2∶1的比例加入堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶，使最終加酶量為9 000 U/g，60 ℃搖床酶解3 h，沸水浴滅酶10 min后離心取上清液，過分子質量為5 000 Da的透析袋，透析液旋轉蒸發濃縮后，冷凍干燥制成核桃多肽粉。通過雙縮脲法測得核桃多肽含量為75.43%。將核桃多肽粉用核桃乳作為溶劑復溶，質量濃度為100 mg/mL，高壓均質后得到核桃多肽復配核桃乳。

大豆多肽復配核桃乳制備：將大豆多肽粉用核桃乳作為溶劑復溶，質量濃度為100 mg/mL，高壓均質后得到大豆多肽復配核桃乳。

1.4 實驗動物

昆明小鼠，SPF 級，體質量22～26 g，雄性，河北醫科大學所提供。動物分組飼養于12 h明暗交替的鼠房中，鼠房溫度為18～21 ℃，相對濕度為(50±5)%，標準飼料飼養，可自由攝食、飲水。

分組處理情況：取雄性小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，分別為空白組(NC)，疲勞模型組(FC)，實驗組：核桃蛋白復配核桃乳組(WEP)、核桃多肽復配核桃乳組(WPP)、大豆多肽復配核桃乳組(SP)。WEP組、WPP組、SP組分別灌胃5 mL/(kg·d)(按照60 kg成人每天飲用300 mL核桃乳為標準)的核桃蛋白復配核桃乳、核桃多肽復配核桃乳、大豆多肽復配核桃乳，每天灌胃1次，NC組及FC組正常飲水進食，連續灌胃28 d后，小鼠開始進行懸掛、爬桿、游泳、負重游泳4種運動實驗，每天完成1種，記錄實驗數據。各試驗組進行游泳運動后，將各組小鼠撈出擦干，摘眼球取血，脫頸處死，測定疲勞與抗氧化等生理生化指標。

小鼠運動性疲勞模型的建立：小鼠采用游泳運動的方式進行疲勞模型的建立，除NC組小鼠，FC組、WEP組、WPP組和SP組小鼠每周進行6次游泳訓練，周日休息，每天下午4點開始，每次訓練60 min，避免小鼠在水上漂浮偷懶，不時用玻璃棒攪動水面，使小鼠產生疲勞。

1.5 方法

1.5.1 小鼠體質量及臟器指數測定

每周稱量并記錄小鼠體質量，4周后小鼠脫頸處死，取心、肝、脾、腎、腎周脂肪、睪丸、附睪脂肪稱取質量，記錄數據。通過公式(1)計算臟器指數：

(1)

1.5.2 懸掛實驗

參考文獻[19]方法，將小鼠雙前肢懸掛在水平電線上，觀察小鼠，若2只后肢均能抓住電線，記3分；僅能用1只后肢抓住電線，記2分；2只后肢均不能抓住電線，記1分；小鼠跌落記為0分。

1.5.3 爬桿實驗

參考文獻[20]方法，小鼠灌胃30 min后，開始爬桿試驗，將小鼠懸掛在一長30 cm，直徑約0.6 cm的光滑鐵桿上端，開始計時，當小鼠肌肉疲勞滑落下來，停止計時，記3次滑落時間之和作為爬桿時間。

1.5.4 游泳實驗

參考文獻[21]中游泳實驗方法：小鼠灌胃30 min 后，放入一個水深約15 cm，水溫約25℃的方形游泳箱中，讓其自由游泳，若小鼠能夠在1 min內持續游泳，記3.0分；30 s以上時間持續游泳僅偶爾漂浮，記2.5分；30 s以上時間漂浮，記2.0分；僅偶爾游泳，記1.5分；持續漂浮，記1.0分，取5次實驗結果平均值為小鼠最終得分。

參考文獻[22]中負重游泳實驗方法：小鼠灌胃30 min后，每只小鼠尾部綁上占體質量5%的小玻璃珠，放入游泳箱開始負重游泳，游泳箱水深約30 cm，水溫約25 ℃。將小鼠放入水中開始計時，至小鼠力竭結束計時，力竭標準為小鼠沉入水下7 s不上浮。

1.5.5 疲勞及抗氧化生理生化指標的測定

小鼠血清、骨骼肌或肝臟中乳酸含量，肝/肌糖原含量，尿素氮含量，MDA含量、T-AOC能力、CAT酶活力、GSH-PX酶活力、SOD酶活力均按相對應的試劑盒中的方法測定。

2 結果與分析

2.1 小鼠體質量及臟器指數

小鼠的體質量增長情況及臟器指數反應了小鼠的機體健康狀態，小鼠的體質量增長情況見表1，小鼠臟器重質量及臟器指數見表2，在連續灌胃4周后，各組小鼠體質量均呈增長趨勢，小鼠體質量增長在試驗前、中、末期與NC組相比均無顯著性差異(P>0.05，n=10)，各臟器質量與臟器指數與NC組相比無顯著性差異(P>0.05，n=10)，表明灌胃的核桃多肽復配核桃乳、核桃蛋白復配核桃乳及大豆多肽復配核桃乳對小鼠機體均無毒副作用。

2.2 耐力實驗

運動耐力的提高是評估抗疲勞活動的重要指標，通過小鼠的運動耐力直接證實了抗疲勞效果[23]。懸掛實驗用來測定小鼠的肢體肌力，評分越高，小鼠肢體肌力越強，耐疲勞效果越好。爬桿實驗考察了小鼠肌肉對靜態力的持久能力，爬桿時間的越長，小鼠的肌肉持久力越長，耐疲勞程度越強。游泳實驗考察了小鼠的運動耐力，若小鼠能在水中連續不斷地游泳，評分越高，運動耐力越強，抗疲勞效果越顯著[24]。負重游泳測試是評估抗疲勞實驗運動的模型，用負重游泳時間長短來代表小鼠的疲勞程度[25]。

表1 小鼠體質量變化表 單位：g

表2 小鼠臟器指數 單位：%

由圖1-a可知，各組懸掛評分排序為：WPP組2.8分>SP組2.5分>WEP組2.4分>NC組2.3分>FC組2.1分。WPP組懸掛評分與FC組相比存在顯著性差異(P<0.05，n=10)，表明核桃多肽復配核桃乳有效提高了小鼠的肢體肌力。由圖1-b可知， WEP、WPP、SP組與FC組相比顯著延長了小鼠的爬桿時間，爬桿時間分別是FC組的2.15、2.70、2.28倍，表明3種復配核桃乳提高肌肉對靜態力的持久能力效果顯著，肌肉耐疲勞程度順序為WPP組>SP組>WEP組。由圖1-c可知，各組游泳評分排序為：WPP組2.60分>SP組2.40分>WEP組2.36分>NC組2.05分>FC組1.75分，WPP組相與NC組比差異極顯著， WPP、SP組與FC組相比差異顯著，3種復配核桃乳均在一定程度上提高了小鼠的運動耐力，核桃多肽及大豆多肽復配核桃乳耐疲勞效果更顯著。由圖1-d可知，WEP、SP組與NC組比差異不顯著，WPP組與NC組比差異極顯著，WEP、WPP、SP 組與FC組相比均能極顯著延長小鼠的負重游泳時間，分別是FC組的2.57、3.53、2.69倍，3種復配核桃乳均能有效增強小鼠的抗疲勞能力，耐疲勞程度順序為WPP組>SP組>WEP組。

a-小鼠懸掛評分;b-小鼠爬桿時間;c-小鼠游泳實驗評分;d-鼠負重游泳時間,(x±s,n=10)圖1 耐力實驗Fig.1 Endurance test 注：*表示與FC組比存在顯著性差異(P<0.05)，**表示與FC組比存在極顯著性差異(P<0.01)； #表示與NC組比存在顯著性差異(P<0.05)，##表示與NC組比存在極顯著性差異(P<0.01)(下同)

2.3 疲勞生理生化指標測定

在進行高強度、長時間運動時，機體中的糖進行無氧酵解產生大量的乳酸從而獲得足夠能量，乳酸的含量可以反映組織供氧和代謝狀態，是評價機體疲勞的一個重要指標[26-27]。由表3可知，WEP、WPP、SP各實驗組血清和骨骼肌中乳酸含量與FC組相比均極顯著降低(P<0.01)，血清中各組分別降低了32.60%、37.81%、35.20%，骨骼肌中各組分別降低了20.00%、37.20%、24.72%，說明各實驗組均能夠增強乳酸的有氧代謝活動[28]，緩解機體的疲勞狀態；血清尿素氮是評價機體疲勞的另一個重要的指標，由表3可知，WEP、WPP、SP組與FC組相比血清尿素氮的含量均極顯著降低，分別降低了15.03%、39.40%、19.62%，表明3種復配核桃乳均能夠有效清除血清尿素氮的累積，降低運動過程中對機體造成的損傷，乳酸和尿素氮代謝效果依次為：WPP組>SP組>WEP組。

表3 疲勞生理生化指標Table 3 Fatigue physiological and biochemical indicators

肝/肌糖原的儲量是產生疲勞的決定性因素，當機體需要供能時，肝/肌糖原可以迅速供給以滿足機體需求[29]，兩者含量的高低與機體抗疲勞能力成正相關。由表3可知，WEP、WPP、SP組中肝糖原含量與FC相比有極顯著性差異，分別為FC組的1.50、1.64、1.44倍，說明高強度耐力運動使FC組小鼠肝糖原的消耗大于積累，導致運動組小鼠肝糖原的耗竭，而WEP、WPP、SP各實驗組肝糖原含量充足，其中WPP組含量最高7.43 mg/g，差異最為顯著，小鼠運動耐力最強；肌肉中的糖以肌糖原的形式儲存，在機體劇烈運動大量消耗血糖時，肌糖原開始分解，提供能量[30]。WEP、WPP和SP組的肌糖原含量與FC組比有顯著差異，分別提高了1.31、1.48、1.41倍，其中WPP組肌糖原含量最高達1.54 mg/g，肌糖原供應充足，有效提高了小鼠運動耐力。

2.4 抗氧化生理生化指標測定

2.4.1 SOD酶活力的測定

活性氧(reactive oxygen species,ROS)和抗氧化劑分子之間的不平衡引起氧化應激反應，氧化應激和ROS是引起機體運動疲勞最重要原因，尤其是骨骼肌中的氧化失衡會導致肌肉疲勞增加[31]。因此，提高體內抗氧化酶的活性，進而增強機體的防御機制，能夠起到抗疲勞的作用[32]。SOD能夠有效清理超氧陰離子自由基，通過抵消氧化應激來緩解疲勞[33]。由圖2可知，小鼠血清、肝臟和骨骼肌中FC組與NC組比SOD酶活力均極顯著降低，疲勞模型成立；小鼠血清、肝臟和骨骼肌中各實驗組SOD酶活力與NC組相比，WEP、SP組均無顯著性差異，WPP組SOD酶活力有極顯著升高趨勢，3組均有效提高了疲勞小鼠體內SOD酶活力，能有效清除超氧陰離子自由基。WEP、WPP、SP 組SOD酶活力與FC組相比均呈明顯升高趨勢，血清中分別升高0.24、0.37、0.30倍，肝臟中分別升高0.20、0.30、0.26倍，骨骼肌中分別升高0.37、0.48、0.39倍，均有極顯著差異。表明3種復配核桃乳均可有效提高小鼠耐力運動后肝臟SOD酶活力，對提高SOD酶活力影響順序依次為WPP>SP>WEP。

a-血清；b-肝臟；c-骨骼肌圖2 核桃蛋白乳、核桃多肽乳和大豆肽乳對小鼠SOD活力的影響Fig.2 Effects of walnut protein milk, walnut polypeptide milk and soy peptide milk on SOD activity in mice

2.4.2 GSH-PX酶活力的測定

由圖3可知，小鼠血清、肝臟和骨骼肌中FC組與NC組相比，GSH-PX酶活力均極顯著降低，分別降低了51.3%、36.6%、52.0%，疲勞模型成立；小鼠血清、肝臟和骨骼肌中WEP、WPP、SP各實驗組的 GSH-PX酶活力與NC組相比均有升高趨勢，WPP組GSH-PX酶活力均有極顯著差異，WEP組差異均不顯著，SP組在血清及肝臟中GSH-PX酶活力差異顯著，骨骼肌中差異不顯著，3組均有效提高了疲勞小鼠體內的 GSH-PX酶活力。WEP、WPP、SP 組GSH-PX酶活力與FC組比均呈明顯升高趨勢，血清中GSH-PX酶活力分別提高2.13、2.70、2.48倍，肝臟中分別提高1.74、1.94、1.87倍，骨骼肌中分別提高2.16、2.58、2.27倍，均有極顯著差異。表明3種復配核桃乳均可提高耐力運動后疲勞小鼠體內的 GSH-PX酶活力，有較強的清除ROS的能力，可以有效緩解機體運動后的疲勞感，對提高GSH-PX酶活力影響順序依次為WPP>SP>WEP。

a-血清；b-肝臟；c-骨骼肌圖3 核桃蛋白乳、核桃多肽乳和大豆肽乳對小鼠GSH-PX活力的影響Fig.3 Effects of walnut protein milk, walnut polypeptide milk and soy peptide milk on the activity of GSH-PX in mice

2.4.3 CAT酶活力的測定

由圖4可知，小鼠血清、肝臟和骨骼肌中FC組與NC組相比，CAT酶活力均極顯著降低，分別降低了38.0%、55.1%、61.8%，疲勞模型成立；小鼠血清、肝臟和骨骼肌中WEP組與NC組比CAT酶活力均無顯著性差異，WPP組與NC組比CAT酶活力均有極顯著升高趨勢，SP組與NC組比CAT酶活力在血清中差異顯著，肝臟和骨骼肌中差異不顯著，WEP、WPP、SP 組對疲勞小鼠體內CAT酶活力的升高有明顯促進作用。WEP、WPP、SP 組CAT酶活力與FC組相比均呈明顯升高趨勢，差異極顯著，血清中GSH-PX酶活力分別提高1.86、2.13、2.00倍，肝臟中分別提高2.46、2.71、2.47倍，骨骼肌中分別提高3.01、3.99、2.63倍。表明3種復配核桃乳均能有效分解過氧化物，阻斷過氧化鏈，緩解氧化應激導致的機體疲勞，對提高CAT酶活力影響順序依次為WPP>SP>WEP。

a-血清；b-肝臟；c-骨骼肌圖4 核桃蛋白乳、核桃多肽乳和大豆肽乳對小鼠CAT活力的影響Fig.4 Effects of walnut protein milk, walnut polypeptide milk and soy peptide milk on CAT activity in mice

2.4.4 MDA含量的測定

MDA是自由基作用于脂質發生過氧化反應的氧化終產物，具有細胞毒性，自由基過量積累能夠與核酸、膜脂、細胞蛋白等反應導致機體氧化損傷，因此細胞的受脂質氧化的損傷程度可以通過 MDA 的含量反映出來[34]。由圖5可知，小鼠血清、肝臟和骨骼肌中FC組與NC組比MDA含量急劇上升，分別為NC組的2.02、2.95、1.81倍，有極顯著性差異(P<0.01)，疲勞模型成立；WEP、WPP、SP 各組MDA含量與NC組相比，WPP組在血清、肝臟及骨骼肌中均無顯著性差異(P>0.05)，SP組在肝臟和骨骼肌中無顯著性差異。WEP、WPP、SP 3組MDA含量與FC組比均呈明顯降低趨勢，血清中分別下降34.1%、49.0%、43.1%，肝臟中分別下降49.8%、64%、61%，骨骼肌中分別下降20.8%、37.9%、34.3%，均有極顯著差異。表明3種復配核桃乳均可降低小鼠劇烈運動后血清及臟器中 MDA的含量，加速MDA的及時清除，避免機體產生氧化損傷，對MDA清除效果強弱順序依次為WPP>SP>WEP。

a-血清；b-肝臟；c-骨骼肌圖5 核桃蛋白乳、核桃多肽乳和大豆肽乳對小鼠MDA含量的影響Fig.5 Effects of walnut protein milk, walnut polypeptide milk and soy peptide milk on MDA content in mice

2.4.5 T-AOC的測定

圖6比較了各組在血清、肝臟及骨骼肌中的T-AOC。小鼠血清、肝臟和骨骼肌中FC組與NC組比T-AOC均極顯著降低，分別降低了38.3%、77.4%、90.3%，疲勞模型成立；小鼠血清、肝臟和骨骼肌中WEP、WPP、SP 組與NC組比T-AOC均無顯著性差異，表明3種復配核桃乳均有效提高了疲勞小鼠體內總抗氧化能力。WEP、WPP、SP 組T-AOC與FC組比呈明顯升高趨勢，血清中T-AOC分別提高1.76、2.04、1.64倍，肝臟中分別提高2.34、6.58、3.69倍，骨骼肌中分別提高8.35、14.31、12.22倍，對提高疲勞小鼠體內總抗氧化能力影響順序依次為WPP>SP>WEP。

a-血清；b-肝臟；c-骨骼肌圖6 核桃蛋白乳、核桃多肽乳和大豆肽乳對小鼠T-AOC的影響Fig.6 Effect of walnut protein milk, walnut peptide milk and soybean peptide milk on mouse T-AOC 注：在37 ℃時，每分鐘每毫克血清或組織蛋白是反應體系的吸光度值每增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位

3 結論

3種復配核桃乳均能一定程度上提高小鼠的運動耐力，有一定的抗疲勞效果，其中核桃多肽復配核桃乳的抗疲勞效果更為顯著。3種復配核桃乳均能顯著增強小鼠血清和骨骼肌中乳酸的有氧代謝活動，清除血清尿素氮的累積，提高肝糖原和肌糖原含量，其中核桃多肽復配核桃乳代謝乳酸效果最顯著。3種復配核桃乳均可降低小鼠劇烈運動后血清及臟器中 MDA的含量，加速MDA的及時清除，均有較強的 GSH-PX，CAT及SOD酶活力，可以有效清除體內的ROS，其中WPP組抗氧化酶活力最強，總抗氧化能力最強，抗氧化效果最好。本研究結果將為未來功能性核桃乳的開發與應用奠定理論基礎。