紅樹莓提取物在乳酸菌發酵飲料中的應用

欒生超，王建新

(陜西省榆林市林業工作站， 陜西 榆林， 719000)

紅樹莓(RubusidaeusL.)是一種薔薇科懸鉤子屬的漿果，果實多汁可口，營養豐富，富含多酚、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)、水楊酸和樹莓酮等多種生物活性成分[1-3]，具有良好的藥食同源性。樹莓也是一種很好的多糖來源[4]，有些品種多糖含量甚至高達12%[5]。目前，國內對于紅樹莓多糖的研究報道較少。

乳酸菌具有調節腸道菌群、增強機體免疫力、緩解過敏和降低膽固醇等作用[6-9]，能夠降低腸道中引發致癌的相關酶(如葡萄糖醛酸酶、硝基還原酶)活性[10]。雙歧桿菌作為維持人體腸道菌群平衡的有益菌[11]，一直廣泛應用于飲料、乳制品等食品加工中[12]。研究表明，黑加侖果汁中的多糖可以抑制腸道沙門氏菌生長并促進乳桿菌增殖[13]；低叢藍莓果實中的多糖能夠促進鼠李糖乳桿菌的腸道定植[14]；枸杞多糖能促進乳酸菌增殖[15]。然而，有關紅樹莓多糖與乳酸菌生長關系的研究報道較少。

我國野生樹莓資源豐富，樹莓產量逐年提高[16]，開發高值化加工方式有助于推進樹莓種植業的發展。本研究以粗多糖得率為指標，通過單因素與響應面正文試驗，探究樹莓提取物的適宜制備參數；將樹莓提取物加入MRS培養基，探討樹莓多糖與乳酸菌生長的關系。在此基礎上，對乳酸菌制備發酵樹莓飲料的理化與感官特性進行評估，旨在為樹莓果實的進一步利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

供試菌株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)121、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM，上海杜邦公司;長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)1.218 6，北京林業大學生物學院林業食品加工與安全北京市重點實驗室。首先，取1.0 g冷凍干燥菌粉到1.0 mL無菌蒸餾水中溶解，按照10%(體積分數)的接種量將乳桿菌和雙歧桿菌分別接種于 MRS液體培養基和BBL液體培養基中，37 ℃厭氧培養18 h，傳代2次恢復菌株活力。

紅樹莓果實品種為海爾特茲(Heritage)，由陜西省榆林市林業工作站提供。

1.2 主要試劑和儀器

無水乙醇、苯酚，天津市永大化學試劑有限公司；濃H2SO4、石油醚，北京化工廠。以上試劑均為分析純。乙腈(色譜純)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；FD-1冷凍干燥機，北京德天佑科技發展有限公司；QsonicaQ700智能型超聲波破碎儀，奧然科技有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機，武漢華科達實驗設備有限公司；SHB-III循環水式多用真空泵，上海振捷實驗設備有限公司；RE-2000A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 樹莓中主要營養成分含量測定

果實多糖含量采用高效液相色譜法測定。參照GB 5009.8—2016 《食品安全國家標準 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》第一法，選用氨基色譜柱(250 mm×4.6 mm)；流動相：V(乙腈)∶V(水)=70∶30；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；示差折光檢測器溫度：40 ℃；蒸發光散射檢測器溫度：80～90 ℃；氮氣壓力：508 kPa。

果實中蛋白質含量采用凱氏定氮法測定。稱取4.0 g樹莓果漿于消化管中，再加0.4 g CuSO4、0.6 g K2SO4及20.0 mL濃H2SO4于消化爐中消化。消化爐溫度達到420 ℃后，持續消化1 h，再取出冷卻，加入50.0 mL蒸餾水于自動凱氏定氮儀上測定。

果實中脂肪的測定采用索氏抽提法。稱量3.0 g樹莓果漿，100 ℃烘箱中烘干后取出研細，全部移入濾紙筒內。將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內，連接已經干燥至恒定質量的接收瓶，使用石油醚不斷回流抽提8 h。提取結束后取下接收瓶，待接收瓶內溶劑剩余2.0 mL時在水浴上蒸干，再于100 ℃干燥1 h，冷卻后稱量。重復以上操作直至2次稱量差≤2 mg。

其余營養元素的具體測定方法見表2。

1.4 樹莓提取物中多糖制備條件優化

樹莓提取物制備工藝流程：

樹莓果漿 →水浴浸提 →果渣超聲 → 合并抽濾 →濾液濃縮 → 醇沉→ 離心(收集沉淀)→ 冷凍干燥 → 收集

樹莓提取物收集后，測定其多糖含量。準確稱取0.1 g樹莓提取物溶解于適量蒸餾水中，吸取0.1 mL提取物溶液，分別加入1.9 mL蒸餾水，空白對照為2.0 mL蒸餾水，之后加入1.0 mL 60 g/L苯酚溶液，搖勻后迅速加5.0 mL濃H2SO4于試管中，搖勻后置于沸水浴中加熱15 min，迅速冷卻至室溫，測定OD490 nm，按公式(1)計算糖含量:

(1)

式中：ρ,溶液質量濃度,mg/mL；D,稀釋倍數；V,提取液體積,mL；m,樣品干質量,g。

1.4.1 葡萄糖標準曲線制作

準確稱取烘干至恒定質量的葡萄糖標準品25.0 mg，用蒸餾水定容至250 mL容量瓶中，即得到0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。準確吸取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL葡萄糖標準溶液置于試管中，加蒸餾水至2.0 mL，空白對照加2.0 mL蒸餾水，再各加入1.0 mL 60 g/L的苯酚溶液，搖勻后再迅速加入5.0 mL濃H2SO4，搖勻后沸水浴中加熱15 min，迅速冷卻至室溫，測定OD490 nm，以葡萄糖質量濃度為x，吸光值為y，得到標準方程y=13.25x-0.006 7，相關系數R2=0.998 7。

1.4.2 料液比選擇

準確稱取樹莓果漿每份50 g，按照料液比1∶2、1∶3、1∶4和1∶5(g∶mL)分別加入蒸餾水，在300 W、40 kHz超聲水浴處理40 min，取出后8 000 r/min離心10 min，冷卻至室溫取出上清液，將沉淀置于超聲波破碎儀中破碎15 min(工作5 s，間隔5 s)，之后與上清液合并抽濾，將濾液在60 ℃、40 r/min下旋轉蒸發得到濃縮濾液后，按照濾液體積保證乙醇體積分數為85%，在4 ℃下醇沉24 h，然后8 000 r/min離心10 min收集沉淀物，冷凍干燥即得到樹莓提取物。

1.4.3 提取時間選擇

準確稱取樹莓果漿每份50 g，按照料液比1∶3(g∶mL)分別加入蒸餾水，在300 W、40 kHz超聲水浴中分別處理30、40、50和60 min，后續步驟與1.4.2方法一致。

1.4.4 乙醇體積分數選擇

準確稱取樹莓果漿每份50 g，按照料液比1∶3(g∶mL)分別加入蒸餾水，在300 W、40 kHz超聲水浴中處理40 min，醇沉前步驟與1.4.2方法一致，之后按照濾液體積保證乙醇體積分數為65%、75%、85%和95%，在4 ℃下醇沉24 h，8 000 r/min離心10 min收集沉淀物，冷凍干燥即得到樹莓提取物。

1.4.5 響應面分析

以料液比A、超聲時間B和乙醇體積分數C為自變量，粗多糖提取率Y為因變量，設計響應面實驗，因素水平設置如表1所示。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels for optimizing extraction of raspberry polysaccharide via response surface analysis

1.5 乳酸菌生長狀況的評價

配制MRS培養基和BBL培養基[17]，同時按照每升MRS液體培養基中20 g葡萄糖+5 g樹莓提取物、15 g葡萄糖+5 g樹莓提取物的比例分別配制樹莓改良MRS液體培養基，按照每升BBL液體培養基中20 g葡萄糖+5 g樹莓提取物的比例配制樹莓改良BBL液體培養基。其中樹莓提取物溶液使用0.22 μm針頭式過濾器過濾以達到除菌目的。其余組分則使用高壓滅菌鍋在121 ℃滅菌20 min。接著在無菌環境中混合并使用滅菌的NaOH溶液(1 mol/L)調節改良培養基pH至6.5。

將活化好的植物乳桿菌121、嗜酸乳桿菌NCFM和長雙歧桿菌1.2186分別按照5%(體積分數)接種量接入MRS培養基、BBL培養基及對應的改良培養基中，在37 ℃培養12 h，其中BBL培養基與BBL改良培養基置于無氧環境中培養，然后進行平板計數[18]。

1.6 雙歧桿菌發酵樹莓果汁的理化性質探究

取樹莓鮮果分為等質量的2份，將其中一份樹莓鮮果打漿，依次用普通濾紙、0.80、0.45和0.22 μm超濾膜減壓真空抽濾，過濾出澄清果汁。然后將另一份樹莓鮮果提取物與已過濾除菌的樹莓果汁混合。將混合后的果汁攪拌均勻，分為等體積的2組，一組按照108CFU/100 mL的接種量接入長雙歧桿菌1.2186，置于37 ℃靜置發酵12 h，接著轉入4 ℃貯藏 24 h。另一組果汁則一直貯藏于4 ℃。

依據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]測定2組樹莓果汁中的總酸、揮發性酸和pH等指標，依據GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》[20]測定2組樹莓果汁中的總黃酮?；ㄉ蘸康臏y定則采用吸光光度法測定矢車菊-3-葡萄糖苷(樹莓中的主要花色苷)的濃度，分別在pH值為1.0和4.5的條件下，測定OD510 nm計算獲得花色苷含量[21]。單寧和總酚的測定方法分別參考陳國剛等[22]和郎惠云等[23]的方法。

取2組果汁各2.0 mL，加入2.0 mL 0.1 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy1,DPPH)無水乙醇溶液，搖勻，靜置20 min。以無水乙醇作為空白，測定OD517 nm值記為A樣品；將樣品果汁稀釋，按照相同方法測得吸光度得A對照；將2.0 mL的DPPH溶液與無水乙醇混合，靜置20 min后按照相同方法測得吸光度得A空白[24-25]。再按公式(2)計算出DPPH自由基清除率：

(2)

用0.45 μm的針頭式過濾器過濾樣品果汁，用分光光度計測定OD450 nm、OD520 nm、OD570 nm和OD630 nm，根據公式計算出三色值X、Y、Z，從而得出CIE1976Lab參數L*、a*、b*[26]。

1.7 雙歧桿菌發酵樹莓果汁的風味評價

將接種長雙歧桿菌1.2186的樹莓果汁與未接種的樹莓果汁隨機編碼，放在通風良好、無任何氣味的房間內，選擇20名受過感官評價訓練的人員，從外觀(包括顏色熟悉度、顏色深淺和澄清度)、香氣(包括香氣熟悉度、香氣強度和香氣濃郁度)、口感(包括口感熟悉度、甜度、酸度、苦度、澀度和余味強度)方面進行感官評價。感官評價打分均以7分為標準，并統計分析20位評價人員的打分結果。

1.8 數據處理

本研究中所有試驗均重復3次，數據采用Origin 2018軟件進行統計分析，響應面設計采用 Design Expert 11.0軟件完成。實驗數據均為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 樹莓營養元素檢測

海爾特茲樹莓中的營養成分構成如表2所示。結果表明，海爾特茲樹莓鮮果中Ca、Fe、K和P等微量元素含量明顯較其他品種高[27]。樹莓鮮果中主要的單糖組分為果糖及葡萄糖，而粗多糖在沒有優化提取工藝時得率僅為0.21%，與延?，摰萚27]的研究有較大差異。因此，后續實驗對樹莓粗多糖的提取工藝進行優化。綜合對比樹莓鮮果的營養構成與MRS培養基[18]，可知樹莓鮮果中有充足的碳源，微量元素與維生素可以供微生物利用，但是蛋白質比較匱乏。此外，樹莓鮮果中總酸(以檸檬酸計)含量為(1.557±0.002) g/100 g，酸度較高，因此，若使用樹莓提取物培養乳酸菌時需要調節pH。

2.2 樹莓粗提物制備條件的優化結果

2.2.1 單因素試驗分析

圖1-a、圖1-b、圖1-c分別是按照不同料液比、體積分數和超聲時間制備樹莓提取物后，提取物中粗多糖得率的變化。

表2 樹莓鮮果營養成分表Table 2 Raspberry nutrition facts

由圖1可知，當提取的料液比為1∶3(g∶mL)時，粗多糖得率達到最大值2.794%。當超聲時間達到50 min時，粗多糖得率達到最大值2.859%；在醇沉過程中，當乙醇體積分數為85%時，粗多糖得率最大，為3.611%。

a-料液比;b-乙醇體積分數;c-超聲時間圖1 提取因素對粗多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction factors on extraction rate of crude polysacoharide

2.2.2 響應面設計分析

響應面模型F值為25.24，置信區間達99.8%，且P<0.01，說明該模型具有顯著性[28]，且失擬項P<0.01，失擬項顯著，模型構建成功。利用 Design Expert 11 軟件進行多元擬合，獲得提取工藝對料液比(A)、超聲時間(B)和乙醇體積分數(C)的二次多項回歸模型方程為：Y=3.38+0.145 9A+0.267 6B+0.341C+0.089AB+0.055 3AC+0.116 2BC-0.561 6A2+0.037 9B2-0.109 3C2。圖2為響應曲面圖，結合方差分析結果可知，3個因素對樹莓粗多糖提取率的影響程度由大到小依次是乙醇體積分數、超聲時間、料液比。由圖2可知，在料液比約為1∶3(g∶mL)時，樹莓粗多糖得率最高，樹莓粗多糖得率隨超聲水浴時間變長而升高，隨乙醇體積分數升高而升高。樹莓提取物制備的理論最佳工藝為料液比1∶3.191(g∶mL)、超聲時間53.85 min、乙醇體積分數85.64%，最優工藝條件下樹莓粗多糖的得率理論值為3.66%。在此條件下進行3次平行驗證試驗，樹莓粗多糖的得率為3.88%，與理論值接近，表明響應曲面優化的工藝條件可行。

a-A,B互相影響； b-B,C 互相影響；c-A,C 互相影響圖2 提取因素對粗多糖得率影響的響應面圖Fig.2 Response surface plots of the effect of extraction factors on extraction rate of crude polysaccharide

2.3 樹莓提取物對乳酸菌生長數量的作用

由圖3可知，對于植物乳桿菌121和嗜酸乳桿菌NCFM，改良樹莓MRS培養基對于菌株的增殖作用并不明顯，甚至加入樹莓提取物之后，菌株生長反而受到了抑制。但是對于長雙歧桿菌1.218 6，添加5 g樹莓提取物的BBL改良培養基活菌數高于普通BBL培養基，說明樹莓提取物對于長雙歧桿菌1.218 6生長有較好的促進作用。

圖3 各培養基乳酸菌生長情況Fig.3 Growth of lactic acid bacteria in different media

2.4 樹莓果汁的理化指標

表3對比了接種長雙歧桿菌1.2186樹莓果汁與未接種樹莓果汁之間的理化指標。未接種樹莓果汁中揮發酸高達1.349 g/L，而接種菌的樹莓果汁揮發酸含量更高，達2.280 g/L，但是其pH之間差異不顯著。接種菌的樹莓果汁的花色苷、單寧和黃酮等活性物質含量更高，同時也有著更高的DPPH自由基清除率，達94.20%。一般來說，乳酸菌的抗氧化機制主要包括自身產生抗氧化物質[如谷胱甘肽(glutathione,GSH)、葉酸]，參與調節抗氧化信號通路從而下調活性氧自由基的產生[29]。此外，已有研究表明，植物中的黃酮(如荷葉黃酮)可以提高2種益生菌的胞內SOD和GSH酶活力，對保加利亞乳桿菌的抗氧化能力有明顯協同增效作用[30]，這可能是加入長雙歧桿菌的樹莓果汁表現出更強DPPH自由基清除能力的原因。CIELab值分析表明，L*、a*、b*和Cab飽和度值均存在顯著性差異，Hab色調角不存在顯著性差異，并且接種長雙歧桿菌1.2186的樹莓果汁飽和度較高、明亮度高，而未接種菌株的樹莓果汁偏紅色色調的趨勢更加明顯。顯然，2種果汁在上述指標上存在顯著差異。

表3 兩種樹莓果汁的理化指標Table 3 Physical and chemical indexes of two kinds of raspberry juice

2.5 紅樹莓果汁感官品質評估

進一步對2種樹莓果汁進行感官評價，由外觀、香氣評價雷達圖(圖4)可知，2種果汁的顏色評分均較高，果汁的顏色偏淺；在香氣濃郁度方面，整體打分較低，說明香氣較淡。整體來看，結合顯著性差異分析，2種果汁在香氣上無顯著性差異，但在外感描述上，顏色熟悉度、顏色深淺和澄清度3方面均存在顯著性差異。

圖4 外觀、香氣評價雷達圖Fig.4 Radar map about appearance and aroma evaluation of raspberry juice

由口感評價數據分析結果(圖5)可知，在甜度、酸度、澀度和余味強度這4項評價指標上，2種果汁無顯著性差異，而在口感熟悉度、苦度這2個評價指標上，兩者存在顯著性差異。接種長雙歧桿菌1.2186的果汁口感熟悉度較差，苦度相對較低。因此，在果汁開發過程中應該注意調節苦度。

圖5 口感評價雷達圖Fig.5 Radar map about taste evaluation of raspberry juice

3 結論

(1)本研究以海爾特茲品種的紅樹莓為原料，確定其粗多糖提取工藝為料液比1∶3.191(g∶mL)、超聲時間53.85 min、乙醇體積分數85.64%，粗多糖得率為3.88%；體外培養乳酸菌實驗證實樹莓提取物可以被一些乳酸菌利用，如長雙歧桿菌1.218 6，這可能是由于樹莓多糖可用于補充碳源支持、促進乳酸菌生長。

(2)本研究制備的樹莓提取物對長雙歧桿菌1.218 6生長有較明顯的促進作用，采用長雙歧桿菌發酵的含有樹莓提取物的果汁，與對照相比，其DPPH自由基清除率高、抗氧化能力強、果汁飽和度、明亮度好，發酵樹莓果汁的理化及感官特性均有改善。

(3)近年來，我國樹莓種植規模逐年擴大，樹莓鮮果存在易損傷和腐壞問題，大部分果實只能以凍果原料銷售，附加值低，本文開發的樹莓與乳酸菌復配產品工藝，為樹莓產品進一步利用提供了一種新思路。