己糖激酶2促進人宮頸癌細胞系的遷移與增殖

雷 丹，張燕茹，陳 茜，李 露，崔 南*

(1.西安交通大學第一附屬醫院 生殖醫學科,西安交通大學 醫學部，陜西 西安710061；2.西安醫學院第一附屬醫院 腎病科，陜西 西安 710021)

在發展中國家，宮頸癌(cervical cancer)是位居第2的一種女性致死性癌，在全球范圍內，宮頸癌也是排名第4的腫瘤類型。近年來的研究顯示，宮頸癌呈現年輕化傾向， 25歲以下罹患宮頸癌的年輕女性患者逐漸增多[1-2]。

在腫瘤細胞中，即使在氧供充足的情況下，細胞內相當一部分的葡萄糖仍會跳過氧化磷酸化途徑通過糖酵解途徑生成丙酮酸后直接生成乳酸，從而為腫瘤細胞增殖提供能量，該現象稱之為Warburg效應。腫瘤細胞通過采用這種高消耗的代謝方式可以塑造有利于自身增殖的環境，利于腫瘤細胞的存活、快速增殖及腫瘤細胞的遷移和腫瘤的轉移[3]。己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)是己糖激酶(hexokinase,HK)同工酶的一種，通過結合位于線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel, VDAC)蛋白，HK2可以加快糖酵解的進程，為腫瘤細胞增殖提供大量的原料，與腫瘤細胞內異常糖酵解過程密切相關[4]。既往的研究證實，HK2在頭頸部麟癌、乳腺癌、肺癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌、宮頸癌和惡性淋巴瘤等多種腫瘤組織中表達升高。應用HK2抑制劑如3-BP可抑制多種腫瘤細胞的增殖，如人膠質瘤細胞、乳腺癌細胞、多發性骨髓瘤細胞和肝癌細胞等[5]。但是HK2在宮頸癌中的研究仍較少。因此，本研究擬在宮頸癌細胞系HeLa細胞中過表達HK2后，觀察HK2對HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討HK2通過p-ERK1/2上調周期相關蛋白cyclin A和Slug表達促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲作用機制，研究HK2對宮頸癌細胞系HeLa細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細胞系HeLa 細胞、SiHa、C-33A和CaSki(ATCC)。質粒表達載體pCAG-IRES2-AcVEC-neo(本實驗室保存)。HK2、cyclin A、ERK1/2和GAPDH鼠單克隆抗體(Santa Cruz公司)；Slug和p-ERK1/2兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)；DMEM培養基(上海源培生物科技有限公司)；胎牛血清(Biological Industries公司)；Trizol試劑、反轉錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)；其余試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 G418壓力篩選獲取穩定表達HK2蛋白的HeLa細胞系：將人宮頸癌細胞HeLa培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，于5% CO2的37 ℃孵箱中常規培養。將2 μg重組質粒DNA通過Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑轉染于細胞中，G418壓力篩選3～4周后，通過Western blot，鑒定HK2表達陽性的單克隆細胞系。

1.2.2 細胞免疫化學檢測蛋白表達：常規消化對數期的細胞后制備成細胞懸液，接種于0.5 cm×0.5 cm的爬片上， PBS洗滌5 min×3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS 洗滌5 min×3次，加入0.2% Triton X-100，室溫放置10 min。PBS 洗滌5 min×3次后，加一抗，4 ℃濕盒過夜。次日，室溫放置30 min，PBS 洗滌5 min×3次，加二抗，室溫放置30 min。PBS洗滌5 min×3次后，DAB顯色，依次使用：蘇木精染色2 min，鹽酸乙醇分化15 s，氨水反藍15 s，梯度乙醇脫水各5 min，二甲苯透明2 min，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移：將細胞接種于6孔板中至90%～95%匯合度，用20 μL無菌槍頭劃一橫線，PBS清洗細胞3次，加入無血清的DMEM培養基繼續培養24 h，用倒置顯微鏡進行觀察及拍照，選取5個視野進行統計分析。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞的遷移和侵襲：將HeLa細胞饑餓24 h后，將4×105個細胞加入Transwell上室中，下室中加入含 10% FBS的DMEM培養基， 37 ℃孵育。48 h后,用棉簽擦去上室內殘留的細胞,甲醛固定10 min，0.1%的結晶紫室溫孵育10 min, PBS清洗3遍，將小室底面朝上于顯微鏡下拍照,隨機選取5個視野進行計數,統計分析，重復上述實驗3次。

于Transwell上室中平鋪1∶8的matrigel膠50 μL，紫外燈照射消毒6 h后，將細胞懸液加入Transwell上室，下室中加入10% FBS 的DMEM培養基，后續步驟同體外遷移實驗。

1.2.5 細胞計數法和MTT法檢測細胞增殖：將細胞用胰蛋白酶消化后制備成單細胞懸液，按照3×104個/皿接種于6孔板里。分別于1、3、5和7 d，進行細胞計數，繪制細胞增殖曲線，每組試驗設置3個復孔，重復3次。將細胞制成單細胞懸液，以1 000個/孔接種于96孔培養板中。于接種后1、3、5和7 d，用MTT法檢測各組吸光度A值，各實驗組均設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.6 細胞周期分析：胰蛋白酶消化收集細胞，1 000 r/min離心5 min，預冷的PBS洗滌2次，加入預冷的70%乙醇，4 ℃冰箱固定細胞。1 000 r/min離心5 min， PBS洗滌2次。0.01% RNase的PI處理細胞，4 ℃避光染色30 min。流式細胞儀進行檢測，使用CellQuest軟件分析結果。重復試驗3次以上。

1.2.7 Real-time PCR檢測細胞mRNA表達：使用Trizol試劑提取細胞的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA，以NCBI Gene bank提供的人基因序列為模板設計特異性real-time PCR引物(表1)。Real-time PCR按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說明書進行。將各管混勻離心后，置于Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀中進行擴增反應。每個樣品準備3個復管，試驗至少重復3遍。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達：使用細胞裂解液收集細胞蛋白，測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白，電泳結束后，進行轉膜；5%的脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉1 h；加入一抗，4 ℃孵育過夜；次日，TBST洗膜10 min×4次；加二抗室溫孵育1 h；TBST洗膜10 min×4次；化學發光檢測；通過Western blot化學發光成像一體機拍照分析。

1.2.9 抑制p-ERK1/2蛋白在HK2過表達HeLa細胞中表達：ERK1/2抑制劑(FR180204)按照說明書溶于DMSO，后續根據實驗需要稀釋至工作濃度30 μmol/L和60 μmol/L。將細胞培養液更換為含FR180204培養液后：分別進行細胞計數、MMT、Transwell體外遷移實驗和侵襲實驗；收集細胞，加入細胞裂解液收集細胞蛋白，通過Western blot檢測相關蛋白表達。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HK2蛋白在宮頸癌細胞中的表達

HK2蛋白在宮頸癌細胞系HeLa、CaSki、C-33A和SiHa中均有表達(圖1A,B)。在線數據庫的結果顯示，HK2蛋白在宮頸癌組織中的表達高于正常組織(圖1C)(P<0.05)，且HK2高表達提示患者不良預后(圖1D)(P<0.01)(gepia.cancer-pku.cn)。成功構建穩定表達HK2蛋白的HeLa-HK2-2和HeLa-HK2-3細胞系，及對照細胞系HeLa-VEC-1和HeLa-VEC-2 (圖1E)。

A.expression of HK2 in cervical cancer cell lines was detected by Western blot; B. expression of HK2 in cervical cancer cell lines was detected by immunocychemistry; C.expression of HK2 between cervical cancer patients CECS and normal tissues(N) was analyzed by online database, *P<0.05 compared with VEC control group; D.overall survival between HK2-high patients and HK2-low patients was analyzed by online database; E.expression of HK2 in stable transfected HeLa cell was detected by Western blot圖1 HK2在宮頸癌細胞系中的表達Fig 1 Expression of HK2 in cervical cancer cell lines n=3)

2.2 HK2增強HeLa細胞體外遷移和侵襲的能力

與對照細胞相比，過表達HK2顯著增強HeLa細胞體外遷移(圖2A)(P<0.05)和侵襲的能力(圖2B)(P<0.05)。細胞劃痕實驗也發現，在觀察48 h時，HeLa-HK2細胞劃痕的愈合速度快于HeLa-VEC細胞(圖2C，D)(P<0.05)。

A. migratory potential of HK2-overexpressing HeLa cells and the respective control cells was analyzed by the Transwell cell migration assay, and number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; B.invasive potential of HK2-over-expressing HeLa cells and the respective control cells was analyzed by the transwell cell invasion assay, and the number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; C.migratory potential of HK2-over-expressing HeLa cells and the respective control cells was analyzed in a wound-healing assay for 0 and 48 hours(×200); D.scratch area of HK2-over-expressing HeLa cells and the respective control cells; *P<0.05 compared with VEC control group圖2 HK2促進HeLa細胞的體外遷移和侵襲Fig 2 HK2 promoted HeLa cell migration and invasion in n=3)

2.3 HK2促進HeLa細胞的增殖和細胞活力

HK2可以顯著促進HeLa細胞的增殖(圖3A)(P<0.05)和細胞活力(圖3B)(P<0.05)。HK2可以加快細胞周期從G0/G1期向S期的轉換。HeLa-HK2細胞中處于G0/G1的細胞比例明顯少于HeLa-VEC細胞，HeLa-HK2細胞中處于S期的細胞比例明顯多于HeLa-VEC細胞(圖3C，D)(P<0.05)。

A.proliferation of HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells were detected by growth curves; B.viability of HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells were detected by MTT assay; C，D.cell cycle of HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells was analyzed by flow cytometry, and the quantitative analysis；*P<0.05, **P<0.01 compared with VEC control group圖3 HK2促進HeLa細胞體外增殖Fig 3 HK2 promotesd cell proliferation of HeLa cells in vitro n=3)

2.4 HK2上調ERK1/2、p-ERK1/2、Slug和cyclin A蛋白表達

HK2可以上調EMT相關基因CDH2、Slug、vimentin、ZEB1和ZEB2在HeLa細胞中的mRNA的表達量(圖4A)。此外，HK2可以上調周期相關蛋白cyclin A和cyclin D1在HeLa細胞中的mRNA的表達量(圖4A)。HK2可以顯著上調ERK1/2、p-ERK1/2、cyclin A和Slug蛋白在HeLa細胞中的表達(圖4B,C)。

A. expression of CDH1, CDH2, Snai1, Slug, vimentin, ZEB1, ZEB2, HK2, cyclin D1, cyclin A, HK2 HeLa-Vec and HeLa-HK2 cells was detected by real-time PCR, and the quantitative analysis was shown; B.expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Slug, cyclin A in HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells was detected by Western blot, and the quantitative analysis was shown; C.expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Snai2, cyclin A in HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells was detected by immunocychemistry (×100); *P<0.05，**P<0.01 compared with VEC control group圖4 HK2上調HeLa細胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Slug和cyclin A蛋白表達Fig 4 HK2 up-regulated expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Slug and cyclin A in HeLa n=3)

2.5 抑制ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達可以減弱HK2對HeLa細胞增殖及遷移的影響

FR180204可以顯著抑制ERK1/2、p-ERK1/2、cyclin A和Slug蛋白的表達(圖5A)。FR180204可以抑制HeLa-HK2細胞的增殖和活力(圖5B,C)。FR180204 可以抑制HeLa-HK2細胞體外遷移和侵襲能力(圖5D,E)。

A.expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Slug and cyclin A was detected by Western blot in FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells, and the quantitative analysis was shown; B.proliferation of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells were detected by growth curves; C.viability of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells were detected by MTT assay; D.migratory potential of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells was analyzed by the transwell cell migration assay, and number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; E.invasive potential of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells was analyzed by the transwell cell invasion assay, and the number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; *P<0.05，**P<0.01 compared with DMSO control group圖5 抑制ERK1/2 蛋白表達可以減弱HK2對HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的影響Fig 5 Treating with the ERK1/2 inhibitor could inhibite cell growth, migration and invasion that induced by HK2

3 討論

己糖激酶2 (HK2)是己糖激酶的一員，是糖酵解的一種關鍵酶，與惡性腫瘤關系最密切[6-8]。在本研究中，Western blot和細胞免疫化學的結果顯示，在宮頸癌細胞系HeLa、CaSki、C-33A和SiHa中均可檢測到HK2蛋白的表達。在線數據庫中的數據也證實HK2在宮頸癌患者標本中的表達明顯高于正常組織標本，且HK2高表達提示患者的不良預后。

HK2通過增強腫瘤細胞的Warburg效應，可以促進細胞增殖并抑制細胞凋亡[9]。在本研究中，HK2表達可以上調細胞周期相關蛋白cyclin A和cyclin D1在HeLa細胞中mRNA的表達。Western blot和細胞免疫化學的結果證實，HK2可以顯著上調cyclin A在HeLa細胞中的表達。cyclin A作為調節細胞周期進程的一個正向調節分子可以促進多種腫瘤細胞的增殖及腫瘤的生長，在本研究中，HK2通過上調cyclin A在HeLa細胞中的表達可以促進HeLa細胞的體外增殖和細胞活力。此外，real-time PCR和Western blot的結果顯示，HK2通過上調多種EMT相關分子在HeLa細胞中mRNA和蛋白的表達，如CDH2、Slug、vimentin、ZEB1和ZEB2，增強HeLa細胞體外遷移和侵襲的能力。

ERK1/2是MAPK信號傳導通路激酶級聯反應的重要成員之一，ERK1/2經過磷酸化活化后，通過調節下游多種因子的表達(如cyclin A和Slug)參與調節腫瘤細胞的增殖、 侵襲及腫瘤轉移[10-13]。在本研究中，HK2可以顯著上調ERK1/2和p-ERK1/2在HeLa細胞中的蛋白表達。在HK2過表達HeLa細胞中用ERK抑制劑(FR180204)抑制ERK1/2和 p-ERK1/2表達后，可以下調cyclin A和Slug蛋白的表達，并抑制HK2對HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用。上述結果提示，HK2通過上調ERK1/2和p-ERK1/2在HeLa細胞中的表達可以促進細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究發現HK2在宮頸癌中通過活化ERK1/2(p-ERK1/2)，可以上調cyclin A和Slug蛋白的表達，并促進HeLa細胞的體外增殖、遷移和侵襲。但是，HK2通過何種方式上調ERK1/2蛋白表達并增強ERK1/2的活化(p-ERK1/2)，仍有待通過進一步的研究去證實。