NCSTN基因沉默對HaCaT細胞增殖分化的影響

張婉璐 張媛媛 吳英達 程萍 李文銳徐浩翔 王寶璽 何艷艷 李誠讓

1中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病醫院皮膚科，南京210042；2中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院皮膚科，北京100144

張婉璐現在蚌埠醫學院第一附屬醫院皮膚科，安徽233004

反常性痤瘡（acne inversa，AI）的發病與遺傳、環境、免疫、肥胖、吸煙等多種因素有關［1］，具體機制仍不清楚。2010年，Wang等［2］首次發現，部分家族性AI 的發病與編碼γ 分泌酶不同亞單位的基因功能性突變有關。Nicastrin（NCT）蛋白參與γ分泌酶的組裝、成熟及穩定，已發現的AI患者基因突變中，NCSTN 基因突變占大多數［3］，常引起AI 患者NCT 蛋白表達下調［4］。γ 分泌酶切割Notch 受體蛋白參與Notch 信號通路，而Notch 信號通路在表皮細胞的分化、增殖，毛囊的終末分化中發揮關鍵作用［5］。目前認為AI 的始動因素是毛囊漏斗部的角化過度及栓塞［6?7］，組織學上毛囊漏斗部的上皮形態及角化方式與表皮中的角質形成細胞類似。細胞角蛋白（cytokeratin，CK）、內披蛋白（involucrin，IVL）和兜甲蛋白（loricrin，LOR）都是角質形成細胞分化的標志［8］。本研究通過檢測NCSTN 基因沉默的人永生化角質形成細胞（HaCaT 細胞）的增殖活性及多種角蛋白和其他分化分子（IVL、LOR）的表達，探究NCSTN 基因對角質形成細胞增殖分化的影響，為后續探究NCSTN 基因突變引起反常性痤瘡提供新思路。

材料與方法

一、主要試劑與材料

HaCaT 細胞為本實驗室保存。高糖型DMEM培養基、胎牛血清和胰酶（美國Gibco公司），慢病毒載體、質粒、RNAi?Mate 轉染試劑（上海吉瑪制藥技術有限公司），Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司），PrimeScriptTMRT?PCR 反轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司），實時定量PCR 試劑盒AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix（Without ROX Premixed）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），RIPA 裂解液（強）、cocktail蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western 印跡轉膜液、電泳液（上海碧云天生物技術有限公司），牛血清白蛋白（南京生興生物技術有限公司）、Tris?Glycine eXtended（TGX）預制膠4%～15%，Clarity ECL化學發光液（美國Bio?Rad公司），CCK8 試劑盒（日本同仁化學研究所），兔抗人NCT 多克隆抗體、兔抗人IVL 多克隆抗體、兔抗人LOR多克隆抗體（美國Proteintech公司），辣根過氧化物酶標記的兔抗人β肌動蛋白單克隆抗體（美國Cell Signaling 公司），兔抗人CK1多克隆抗體、兔抗人CK5/10/16/19單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG H&L抗體（英國Abcam公司）。

二、方法

1.構建慢病毒介導shRNA沉默NCSTN基因的HaCaT 細胞模型：參考文獻［9］并在相同實驗條件下，用慢病毒介導的靶向NCSTN 基因特異性的短發卡RNA（shRNA）表達質粒轉染HaCaT細胞，構建慢病毒介導shRNA沉默NCSTN基因的HaCaT細胞模型。正常培養的HaCaT細胞分為空白組（僅正常培養）、陰性對照組（轉染空載慢病毒）和shRNA 組（轉染靶向NCSTN基因的慢病毒）。流式細胞儀驗證轉染效率，并經實時定量PCR 及Western 印跡法驗證基因沉默效率，實驗重復3次。

2. 實時定量PCR 檢測HaCaT 細胞中NCSTN、角蛋白、LOR及IVL mRNA的表達：按Trizol說明書提取shRNA 組及陰性對照組細胞總RNA，超微量分光光度計測定RNA 濃度，隨后使用PrimeScriptTMRT?PCR 試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，并用超微量分光光度計測定DNA濃度。檢索NCBI GenBank數據庫設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司負責合成，PCR 引物序列見表1。使用AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix 試劑盒，按說明書進行實時定量PCR。以β 肌動蛋白為內參，采用2-ΔΔCt值表示目的基因mRNA 相對表達量，△Ct = Ct目的基因－Ctβ肌動蛋白，△△Ct = △CtshRNA組－△Ct陰性對照組。實驗重復3次。

反向引物GCGATGTAATGTTGAAGAGGC CTCTGCATTTGTCCGCTTGT CCAGAGGAAACACTGCTTGTGA ATATTCACGGCTCCCACTCC GCGCAGAGCTACCTCATTCT CCATGACCTTGGTGCGGATT ACCTCGCGGGAAGAATAGGA ACAATGGTACGCACCTGACG GGTCTCCTTCTCGTTCTGGATG CTGGGCTTCAATACCGCTGA GCGTCTCAGCTCCGTTAGTT TGGGGTTGGGAGGTAGTTGT CAGCAGTCATGTGCTTTTCCT GCTGTCACCTTCACCGTTCC基因名稱NCSTN CK1 CK5 CK7 CK10 CK14 CK16 CK17 CK18 CK19 CK20 LOR IVL β肌動蛋白正向引物AATGTGAGCTATCCCGAATG CCGAAGGAGAGTGGACCAAC TCAAGAAACAGTGCGCCAAT GCAGGCTGAGATCGACAACA ATGGCAACTCACATCAGGGG GCAGCAGAACCAGGAGTACA CTACGCTGTGAGATGGAGCA GCTCAGCATGAAAGCATCCC TGAGTCCTGTCCTTTCTCTCTC GAAGGATGCTGAAGCCTGGT TGGCCTACACAAGCATCTGG AGCTCTCATGATGCTACCCG TCCTCCAGTCAATACCCATCAG CCATCGTCCACCGCAAAT

3. Western 印跡法檢測HaCaT 細胞中NCT、角蛋白、LOR及IVL蛋白的表達：采用RIPA裂解液及cocktail蛋白酶抑制劑的混合物提取shRNA組及陰性對照組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配制10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠，每孔加入60 μg 蛋白樣品。使用濕轉法電轉至PVDF 膜，5%牛血清白蛋白封閉2 h，分別加入NCT、IVL、LOR、CK1、β 肌動蛋白抗體，1∶1 000 稀釋；CK5、CK10、CK16 抗體，1∶10 000 稀釋；CK19 抗體，1∶50 000 稀釋。4 ℃過夜；再加入1∶2 000稀釋的山羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗膜5 次，每次6 min，ECL 發光。Image J 軟件測定相關分化分子蛋白灰度值。待測蛋白相對表達量=待測蛋白條帶灰度值/β 肌動蛋白條帶灰度值。實驗重復3次。

4.CCK8 實驗檢測HaCaT 細胞的增殖活性：取shRNA 組及陰性對照組對數生長期細胞，加入含10%胎牛血清的完全培養基，制成（5 ～10）×104個/ml細胞懸液。向96孔板各孔中加入100 μl細胞懸液，設置12、24、36、48、60和72 h時間點，每個時間點設置5個復孔，放入37 ℃、5%CO2培養箱中培養。每孔加入10 μl CCK8溶液，37 ℃孵育1 h，測定各時間點450 nm處的吸光度（A值），代表其增殖能力。

5. 統計學分析：應用GraphPad Prism V 7.0 和SPSS 23.0 軟件進行統計學分析并繪制統計圖，數據用±s 表示。兩組計量資料的比較采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、HaCaT 細胞慢病毒轉染效率及NCSTN基因沉默效率的測定

慢病毒轉染后第5 天，空白組HaCaT 細胞形態為上皮樣細胞貼壁生長；陰性對照組和shRNA 組細胞生長狀態良好，形態一致，大小均勻，呈多角形，貼壁生長，排列緊密。倒置熒光顯微鏡下（圖1），陰性對照組和shRNA 組可見綠色熒光，空白組未見熒光表達，提示慢病毒載體系統能有效轉染HaCaT 細胞。流式細胞儀檢測顯示，陰性對照組和shRNA 組穩定轉染HaCaT 細胞熒光率均為90%以上，見圖2。

實時定量PCR 及Western 印跡結果顯示，shRNA 組NCSTN mRNA 及蛋白表達（0.42 ± 0.19、0.30 ± 0.07）均顯著低于陰性對照組（1.00 ± 0.34、1.00 ± 0.26；t = 5.196、2.637，P < 0.001、< 0.05），見圖3。與陰性對照組相比，shRNA 組蛋白表達量下降了70%左右，因此沉默效率達70%。

二、穩定沉默NCSTN 基因對HaCaT 細胞增殖活性的影響

CCK8法顯示，轉染慢病毒24 ～72 h，shRNA組細胞增殖活性均高于陰性對照組，見圖4。

三、實時定量PCR檢測各組細胞中不同角蛋白及IVL、LOR mRNA的表達

如圖5 所示，與陰性對照組相比，shRNA 組HaCaT 細胞中角蛋白CK5、CK1、CK10 mRNA 表達顯著升高（t = 4.330、5.407、3.971，P < 0.05、<0.001、<0.01），CK16、CK19、IVL mRNA 表達顯著降低（t = 5.005、4.933、9.114，P < 0.001、< 0.01、<0.001）。兩組間CK7、CK14、CK17、CK18、CK20及分化分子LOR表達差異均無統計學意義（t=1.454、1.657、0.175、1.230、0.342、1.275，均P>0.05）。

四、Western 印跡法檢測干擾NCSTN 基因表達后對分化分子蛋白表達的影響

如圖6 所示，干擾NCSTN 基因表達后，shRNA組CK5、CK1、CK10、LOR蛋白相對表達與陰性對照組相比差異無統計學意義（t=0.247、0.317、0.343、0.016，均P>0.05），而CK16、CK19和IVL蛋白表達顯著低于陰性對照組（t = 3.787、3.817、2.904，P <0.01、<0.05、<0.05）。

討論

AI 的早期損害表現為毛囊漏斗部上皮的角化過度及異常增生、表皮囊腫形成［6?7］。本文CCK8實驗顯示，NCSTN 基因穩定沉默的HaCaT 細胞增殖活性明顯增強，這或許可以解釋AI 皮損中表皮銀屑病樣增生模式［10］。我們還發現，NCSTN 基因穩定沉默的HaCaT 細胞中，角蛋白CK16、CK19 及終末分化分子IVL表達均顯著降低。

角蛋白是上皮細胞主要的結構蛋白和分化的標志產物，在細胞內外信息傳導、基因調控方面發揮重要作用，其表達模式多種多樣。皮膚基底層中未分化的角質形成細胞主要表達CK5和CK14，而分化特異性角蛋白CK1和CK10表達于角質形成細胞分化的初始階段，是表皮的主要結構蛋白，其中CK1位于基底上層，表達于即將角化的上皮細胞內，CK10主要表達于角化的復層鱗狀上皮中處于角化前期的基底上層細胞內［11］。本研究結果顯示，shRNA組HaCaT細胞中CK1 mRNA表達明顯高于陰性對照組，但其蛋白表達與陰性對照組差異無統計學意義。由于基因表達的調控層次很多，轉錄水平的調控只是一個環節，轉錄后調控、翻譯及翻譯后調控均對蛋白的表達有一定影響，因此，基因的mRNA豐度不一定與其翻譯產物蛋白質的表達呈線性關系［12］。此外，NCSTN基因穩定沉默后HaCaT細胞中早期分化分子CK1蛋白表達并無明顯變化，也提示NCSTN突變可能不影響角質形成細胞的早期分化。

生理情況下，CK16在表皮無表達，但在表皮過度增生性疾病如銀屑病中，CK16 可大量表達［13］。因此，CK16可作為細胞增殖分化的標志分子之一，其表達屬于細胞過度增殖相關聯的替代分化途徑［14］。Janse等［15］認為，CK16表達上調可能是AI發病的繼發事件，先天免疫系統的激活也可能導致CK16 在皮損內表達上調。但本研究結果顯示，NCSTN 基因穩定沉默的HaCaT 細胞中CK16 表達明顯下調。臨床上KRT16 基因突變可導致先天性厚甲綜合征，出現厚甲伴掌跖角化。KRT16基因突變導致CK16 蛋白螺旋結構發生改變，并在細胞中異常聚集，CK16蛋白的正常組裝受到干擾，導致異常角蛋白形成［16］。KRT16 基因敲除或部分敲除的小鼠模型出現掌跖角化樣的皮膚損害，也提示CK16 蛋白異常表達可能導致角化過度［17］。因此，我們推測NCSTN 基因沉默引起的CK16 蛋白表達異常也可能介導表皮角化過度。

CK19 是皮膚、毛囊等處表皮干細胞的標志蛋白［18］，表皮干細胞是皮膚組織特異性的、具有自我更新、高度增殖能力和多向分化潛能的一類細胞，定位于表皮的基底層及毛囊隆突部［19］。生理情況下，CK19僅分布于表皮基底層、外毛根鞘、皮脂腺和汗腺，當表皮干細胞分化成為成熟角質形成細胞后，CK19表達下降，因此可通過測定CK19表達來反映表皮干細胞的分化能力［20］。研究［21］表明，當組織創傷修護時，CK19表達增加，提示表皮干細胞在分化的同時可能也在自我復制。本研究結果顯示，NCSTN基因穩定沉默的HaCaT細胞中CK19表達下調，提示表皮干細胞分化能力降低，可能同時伴隨增殖能力減弱，導致AI皮損的自我修復能力降低。CK19在AI發病中可能發揮作用，但其作用仍不明確。

IVL 是一種可溶性胞質蛋白，主要表達于正常表皮棘細胞上層和顆粒層，目前IVL多作為研究皮膚角質形成細胞終末分化的標志蛋白［22］。本研究顯示，NCSTN基因沉默的HaCaT細胞IVL蛋白表達明顯下降，提示表皮角質形成細胞的終末分化可能延遲。

綜上所述，本研究顯示，NCSTN 基因沉默的HaCaT 明顯過度增殖，同時角蛋白CK16、CK19 及分化分子IVL 表達顯著下降。結合相關文獻我們推測，NCSTN 功能缺失可能部分導致毛囊漏斗部異常角化，終末分化延遲，AI皮損處角質形成細胞過度增殖，毛囊角栓形成，從而導致膨脹的毛囊漏斗部破裂釋放內容物，繼發嚴重的炎癥反應及感染，最終導致AI 的發生。由于疾病的發生發展是一個復雜的過程，而我們僅在NCSTN 基因沉默的HaCaT細胞中進行了初步探究，NCSTN基因突變是否導致免疫細胞發生改變，動物實驗及人類組織是否有相似表現仍需要進一步深究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突