Stanford A型主動脈夾層患者主動脈壁中簇集素的表達水平及其臨床意義▲

霍 博 蔣丁勝 魏 翔 劉立剛

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院心臟大血管外科，湖北省武漢市 430000，電子郵箱：huobo1992@foxmail)

主動脈夾層是指主動脈內膜破裂后，主動脈腔內的血液從破口進入主動脈中膜，并沿主動脈長軸方向擴展，導致血管壁分層形成“雙腔主動脈”。主動脈夾層是一類發病急、病情復雜多變、進展迅速、預后差、誤診率及病死率高的心血管疾病，許多患者的主動脈夾層隨著病情進展逐步擴張最終導致血管破裂[1]。因其發病機制復雜，除外科手術和介入治療外，目前主動脈夾層并無有效的保守治療方案，因此進一步深入研究主動脈夾層的發病機制及防治策略具有重要的理論和臨床意義。

簇集素(Clusterin)是由Blaschuk等[2]于1983年在山羊睪丸液中發現的一種分泌糖蛋白。近年來的研究表明，Clusterin蛋白在心血管疾病發生過程中發揮重要作用，在中國人群中血清Clusterin的表達水平與早期冠狀動脈疾病發生密切相關[3]。Clusterin蛋白可以與血漿HDL和極高密度脂蛋白相結合[4]，廣泛分布于人體多種組織，參與體內多種生理功能，如脂類交換和運輸、補體作用的調節、細胞凋亡、細胞增殖，與干眼癥、阿爾茨海默病、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等疾病的發生都密切相關[5-7]。目前未見關于Clusterin與主動脈夾層關系的研究報道。因此，本研究通過檢測主動脈夾層患者主動脈壁中Clusterin的表達，分析其對主動脈夾層發生的影響，并探討其作為潛在治療靶點的可能性。

1 資料與方法

1.1 樣本來源 樣本來源于2017年至1月至2019年4月間在我院心臟大血管外科進行手術的9例擴張型心肌病或冠心病患者(對照組)和13例Stanford A型主動脈夾層患者(病例組)。對照組主動脈壁組織在心臟移植術中獲得，病例組主動脈壁組織在血管置換術中獲得，兩組的樣本均取自升主動脈部分。所有主動脈夾層患者術前均經計算機斷層掃描血管造影明確診斷。對照組擴張型心肌病經超聲心動圖檢查有心腔擴大與心臟收縮功能減低，并排除其他特異性病因引起的心臟擴大確診。冠心病患者經冠狀動脈造影檢查確診。兩組均排除合并馬凡氏綜合征、創傷性或醫源性主動脈夾層、腫瘤、免疫系統疾病等患者。所有涉及人體組織樣本的采集程序均符合世界醫學協會赫爾辛基宣言的原則，均獲得患者本人或家屬的知情同意。本研究經華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 資料收集 收集所有患者的臨床資料，包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、既往史等。

1.3 主要儀器與試劑 BX53光學顯微鏡(日本Olympus公司)，CFX Connect熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，蛋白電泳及轉膜儀(美國Bio-Rad公司)，ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(美國Bio-Rad)。伊紅染液(批號：G1002)、蘇木精染液(批號：G1004)、EVG染色試劑盒(批號：G1042)均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；TRIzol Reagent購自美國Life Technologies公司(批號：15596018)； Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國羅氏公司(批號：4896866001)； ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司(批號：Q711-02)；放射免疫沉淀(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解緩沖液(批號：P0013)、苯甲基磺酰氟(批號：ST505)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液(5×)(批號：P0015L)均購自碧云天生物技術有限公司；二喹啉甲酸蛋白質定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司(批號：23225)，聚偏二氟乙烯膜購自美國Millipore公司(批號：IPVH00010)，Clusterin一抗購自美國CST公司(批號：34642)，堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG購自美國Jackson ImmunoResearch公司(批號：111-035-003)；丙烯酰胺免染制膠試劑盒(批號：1610183)、ECL化學發光底物(批號：170-5061)均購自美國Bio-Rad公司。

1.4 蘇木精-伊紅染色和EVG彈性纖維染色 術中獲得主動脈組織樣本后，取部分組織立即置于10%福爾馬林中固定。經脫水、固定、石蠟包埋等處理，并將主動脈壁橫向切成5 μm厚的石蠟切片，按照標準流程將切片進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色和EVG彈性纖維染色。蘇木精染液主要使細胞核內的染色質與胞質內的核酸著紫藍色，伊紅染液主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色；EVG彈性纖維染色顯示彈力纖維呈黑色，膠原纖維呈紅色。

1.5 Clusterin基因表達檢測 取凍存主動脈壁組織約100 mg，采用TRIzol法提取總mRNA后，使用oligo(dT)引物和Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄為 cDNA，將所得cDNA產物按1 ∶5體積比稀釋后作為模板，采用實時定量PCR檢測Clusterin基因mRNA的表達水平。Clusterin的上游引物為5′-AGATCTTGTCTGTGGACTGTTC-3′，下游引物為5′-GTATTTCCTGGTCAACCTCTCA-3′；以18 s核糖體為內參基因，上游引物為5′-CTCAACACGGGAAACCTCAC-3′，下游引物為5′-CGCTCCACCAACTAAGAACG-3′。取ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL、 上下游引物各0.5 μL、模板cDNA 2 μL和ddH2O 2 μL制備反應體系。反應條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s，40個循環。所有反應均設3個復孔，記錄PCR儀返回的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算病例組主動脈壁組織中Clusterin表達量的倍數。先分別計算兩組各樣本目的基因的ΔCt，ΔCt1=CtClusterin-Ct18 s；再計算出對照組目的基因ΔCt的均值ΔCt2；分別計算兩組各樣本相對于ΔCt2的ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt1-ΔCt2；最后利用2-ΔΔCt計算出兩組個樣本Clusterin的相對表達量。

1.6 Clusterin蛋白表達檢測 取凍存主動脈壁組織約100 mg，將組織剪碎后進行研磨。采用RIPA裂解緩沖液提取主動脈壁組織中的總蛋白，使用二喹啉甲酸蛋白質定量試劑盒測定蛋白質濃度，嚴格按照說明書進行操作。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術將24 μg總蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上(恒壓80 V，電泳2 h)后，將膜置于5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，置于含有相應一抗的抗體稀釋液(1 ∶1 000)中4℃孵育過夜；次日用含0.1% Tween 20的Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜3次，5 min/次；隨后加入相應堿性磷酸酶標記的二抗(1 ∶20 000)，室溫下孵育1 h；用含0.1% Tween 20的Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜3次，5 min/次；加入顯影液立即顯影，在成像系統中檢測蛋白信號。Clusterin有不同剪切體，分子量大小分別為32 000、52 000、53 000，故在蛋白圖像上會顯示3個條帶。按丙烯酰胺免染制膠試劑盒說明書制膠后在250 V電壓下電泳30 min，Bio-Rad凝膠成像系統選擇蛋白質凝膠免染膠成像模式激活2.5 min后得到樣品的總蛋白條帶；用Image Lab軟件檢測每條泳道的所有蛋白條帶將總蛋白歸一化定量，以Clusterin與總蛋白比值作為目的蛋白相對表達水平[8]。

1.7 免疫組化染色 將未經染色的石蠟切片置于65℃烤箱中1 h，常規二甲苯浸洗切片3次進行脫蠟；梯度酒精水合，雙蒸水漂洗，微波爐中進行檸檬酸緩沖液抗原修復，置于3% H2O2中孵育20 min，用磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次；8%山羊血清室溫封閉1 h，滴加Clusterin一抗(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，次日用磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次，二抗(1 ∶500)室溫孵育30 min，用磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次后行二氨基聯苯胺顯色，在光學顯微鏡下觀察拍照。用Image J圖像處理軟件測定主動脈壁組織Clusterin的平均光密度值，其表達水平以圖像3個陽性區積分光密度的平均值表示。

1.8 主動脈直徑測量 在病例組患者的計算機斷層掃描血管造影圖像中分別測量氣管分叉處升主動脈、主動脈弓、降主動脈以及腹腔干處主動脈直徑最大值[9]。

1.9 統計學分析 采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨立樣體t檢驗或t′檢驗；非正態分布的計量資料以中位數和四分位數間距[M(Q)]表示，比較采用秩和檢驗；計數資料以例數或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。采用GraphPad Prism 6.0軟件進行線性相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者的一般資料的比較 病例組患者的收縮壓、合并高血壓比例均高于對照組(均P<0.05)；兩組患者其余各指標比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者的一般資料的比較

2.2 HE染色與EVG染色結果 HE染色結果顯示，對照組主動脈壁結構完整，平滑肌細胞排列規則；病例組患者主動脈壁中層細胞明顯減少，平滑肌細胞排列紊亂。EVG染色結果顯示，對照組主動脈壁中彈力纖維完整無明顯斷裂，而主動脈夾層患者主動脈壁中彈力纖維有所減少且斷裂明顯。見圖1。

圖1 兩組主動脈壁組織HE和EVG染色結果(×400)

2.3 兩組Clusterin mRNA的表達比較 病例組Clusterin mRNA的相對表達水平為[3.718(11.320)]，對照組為[0.053(1.330)]；病例組Clusterin mRNA的相對表達水平高于對照組(z=-2.104，P=0.035)。

2.4 兩組Clusterin蛋白的表達 病例組32 000、52 000、53 000 Clusterin蛋白的相對表達水平分別為(1.865±0.686)、(0.970±0.282)、(2.429±0.893)，對照組32 000、52 000、53 000 Clusterin蛋白的相對表達水平分別為(1.000±0.426)、(1.000±0.145)、(1.000±0.761)；病例組32 000、53 000 Clusterin蛋白表達水平均高于對照組(t=3.348，P=0.003；t=3.911，P=0.001)，而52 000 Clusterin蛋白表達水平差異無統計學意義(t=0.292，P=0.773)。見圖2。

圖2 兩組主動脈壁組織Clusterin蛋白的表達水平

2.5 免疫組織化學染色結果 結果顯示，Clusterin主要表達于細胞質及細胞外基質中。病例組多數細胞的細胞質中可見有明顯的棕染顆粒沉著，對照組主動脈壁中僅有少量Clusterin的表達；病例組Clusterin的相對表達水平為(10.391±0.524)，高于對照組的(0.737±0.110) (t=64.409，P=0.001)。見圖3。

圖3 免疫組織化學染色結果(×400)

2.6 病例組Clusterin mRNA表達水平與各主動脈直徑的相關性 病例組患者主動脈壁Clusterin mRNA的表達水平與降主動脈、腹腔干處主動脈直徑均呈正相關(均P<0.05)。見圖4。

圖4 病例組患者主動脈壁Clusterin mRNA表達水平與各主動脈直徑的相關性

3 討 論

Clusterin在人體精液、尿液、乳液等多種體液以及心、腦、肝、腎等多種組織器官中均有表達，且該蛋白質有不同的分型，包括分泌型和核型[10-11]。有研究顯示，分泌型Clusterin具有促進細胞生長的作用[12]，如在肺動脈高壓大鼠模型中，分泌型Clusterin的表達水平顯著升高；且分泌型Clusterin能通過調控細胞外調節蛋白激酶1/2信號通路來促進肺動脈平滑肌細胞的增殖、遷移，并抑制其凋亡[13]。在動脈粥樣硬化或損傷誘導的血管內膜增生過程中，Clusterin的表達均增加，而敲除Clusterin基因能顯著抑制通過敲除載脂蛋白E基因而誘導形成的動脈粥樣硬化斑塊[14]，但通過腺病毒在主動脈中過表達Clusterin可抑制主動脈平滑肌細胞的增殖和遷移，從而抑制球囊損傷誘導的主動脈內膜增生[15]。由此可見，Clusterin在血管性疾病中發揮重要作用，且在血管損傷過程中會代償性升高。本研究結果顯示，在主動脈夾層患者的主動脈壁中，Clusterin mRNA和蛋白的表達水平均顯著升高，且Clusterin mRNA的相對表達水平與降主動脈和腹腔干處主動脈直徑呈正相關性，提示Clusterin表達升高可能不僅參與主動脈夾層的發生，還與主動脈擴張的進展相關。

目前認為，主動脈夾層的基礎病理變化與主動脈中層退行性變有關。主動脈中層退行性變致使主動脈中層彈力纖維斷裂、發生中層空泡變性，并出現大量蛋白聚糖和黏多糖等胞外基質成分聚集[16]。此外，主動脈夾層中層退行性變還包括因平滑肌細胞凋亡和過度自噬而導致的平滑肌細胞丟失[17]。分泌型Clusterin是一種細胞保護的分子伴侶，具有抗凋亡的作用，但核型Clusterin的表達上調卻是細胞發生凋亡的標志[18]。本研究免疫組化染色結果顯示，在主動脈夾層患者主動脈壁中，Clusterin蛋白的表達顯著升高，且Clusterin主要定位于細胞質及細胞外基質中，提示在主動脈中主要表達的是分泌型Clusterin。因此，我們認為主動脈夾層患者主動脈壁組織中分泌型Clusterin表達上調很可能是一種代償性升高，并不能夠逆轉主動脈夾層患者的細胞損傷。

主動脈夾層發生的分子機制是近年的研究熱點。有研究表明，轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)信號通路在主動脈夾層的發生和發展中起到重要作用[19]，其主要通過調控細胞外基質的動態平衡參與主動脈夾層的病理過程；此外，TGF-β2、轉化生長因子β受體(transforming growth factor β receptor,TGFBR)1、TGFBR2、信號傳導蛋白Smad3以及Smad4的基因突變均可導致主動脈夾層的發生[20]。TGF-β1能誘導Clusterin蛋白的表達升高[21]，而升高的Clusterin可與TGFBR2結合，增加TGF-β誘導的Smad2/3轉錄活性并增加Smad2/3蛋白表達；此外，Clusterin可通過正反饋調控Smad2/3蛋白的穩定性來調節TGF-β信號通路[22]。炎癥是參與主動脈夾層發生發展的重要機制之一，有研究報告，Clusterin能夠調控核因子κB的轉錄活性，參與炎癥信號通路的調節[23]。Clusterin參與調節TGF-β信號通路和炎癥信號通路，而TGF-β和炎癥信號通路與主動脈夾層發生相關，由此推測Clusterin升高對主動脈夾層的發生可能有影響。

此外，有研究報告，高血壓是主動脈夾層發生的主要危險因素之一[24]，而本研究結果也顯示，病例組患者的收縮壓、合并高血壓比例均高于對照組，與既往文獻報道一致。

綜上所述，在急性Stanford A型主動脈夾層患者的主動脈壁中Clusterin表達水平升高，且其表達水平與主動脈夾層患者的降主動脈直徑、腹腔干處主動脈直徑呈正相關。但調控Clusterin表達水平升高的分子機制有待進一步闡明，且Clusterin對主動脈夾層的發生有何影響，以及何種分子機制參與其中，這些問題均有待更深入的研究加以證實。