3種改良B族鏈球菌檢測方法的檢測效果比較▲

金 嫻 譚 萍 樊春卉 朱平安 黃曉彤 張艮芳 陳 芳

(廣東省深圳市鹽田區人民醫院1 檢驗科,2 婦產科,深圳市 518081，電子郵箱：514968029@qq.com)

B族鏈球菌(Group BStreptococcus,GBS)也稱無乳鏈球菌，是導致圍生期感染的重要病原菌。在妊娠晚期，孕婦感染GBS后可導致胎膜早破、流產、絨毛膜羊膜炎、胎兒先天性肺炎及宮內死胎等；而新生兒發生GBS 侵襲性感染可導致重癥肺炎、敗血癥和化膿性腦膜炎等，對孕產婦及新生兒造成嚴重后果[1]。目前，全球范圍內GBS的檢出率因地區、種族差異及檢測方法不一而存在較大差異，其檢出率在5%～30%之間[2-4]。采用直接接種細菌培養法檢測GBS已得到廣泛開展，但是其檢出率低，極易出現漏檢。相關文獻報告，選擇性的肉湯增菌能提高GBS的陽性檢出率[5]，而免疫層析法、PCR法可快速檢測GBS，且檢出率相對較高[4-5]。美國疾病預防控制中心推薦的檢測方法是先對樣本進行增菌，再進行再次培養或者抗原、核酸檢測[6]。但在實際工作中，對樣本增菌后再進行抗原及核酸檢測費時費力，成本高，因此很少采用該方法。本研究結合本院GBS檢測開展情況及相關文獻，比較采用不同方法進行直接檢測及增菌后檢測的檢測效果，為臨床GBS檢測需求提供合理的方案。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年4月至2019年1月在我院產檢的300例孕婦作為研究對象，年齡22～39歲。納入標準：妊娠35～37周。排除1周內使用過抗菌藥或陰道周圍外用清洗劑的孕婦，以及合并嚴重心血管、肝、腎及免疫系統疾病的孕婦及病歷資料不全者。本研究經醫院倫理委員會批準，所有孕婦均知情同意。

1.2 儀器與試劑 儀器：法國梅里埃公司生產的VITEK2 Compact細菌檢定儀，日本松下公司生產的MCO-18ACx型二氧化碳培養箱，美國應用生物系統公司生產的VIIA 7DX型全自動熒光定量PCR儀。試劑：青島海博生物技術有限公司生產的Todd-Hewitt肉湯(Todd-Hewitt Broth,THB)培養基(批號：20171211)、萘啶酮酸(批號：20171028、20180320)、多粘菌素E(批號：20180221)，鄭州安圖生物工程股份有限公司生產的血平板(批號：20180308B、20180606B、20180905B)；中山大學達安基因股份有限公司生產的GBS核酸檢測試劑盒及陰、陽對照試劑盒(批號：2018001)；北京金沃夫生物工程科技有限公司生產的GBS免疫層析法檢測試劑盒(批號：20170801)。

1.3 標本采集 先擦去外陰分泌物，將無菌陰道拭子小心插入陰道內，在陰道下段1/3處旋轉1周采集陰道分泌物，之后將同一根拭子插入肛門，在肛門括約肌上緣2～3 cm 處輕輕旋轉取得直腸分泌物，共采集4根陰道-直腸分泌物樣本。標本采集完成后1 h內送實驗室檢測。將1根置于THB培養基，35℃、5%～10%二氧化碳培養箱內增菌培養，另3根用于直接檢測。

1.4 細菌培養方法 (1)直接培養：取1根樣本采用三區劃線法接種于1個血平板，在35℃、5%～10%二氧化碳培養箱中培養18～24 h，若細菌生長不良則繼續培養至36～48 h。(2)改良培養法：增菌培養18～24 h、36～48 h后，用無菌吸管各取1滴增菌液滴加入血平板上，用三區劃線法接種。接種后的血平板，在35℃、5%～10%二氧化碳培養箱內培養18～24 h。(3)結果判定：在血平板上可疑GBS菌落為灰白色，外表光滑凸起，具有透光性；對可疑菌落進行生化鑒定，革蘭染色陽性，鏡下呈鏈狀排列，觸酶試驗陰性，協同溶血試驗陽性，再采用細菌鑒定儀進行檢測以確認。選取梅里埃公司提供的質控菌株無乳鏈球菌ATCC13813和化膿鏈球菌ATCC19615分別作為陽性和陰性對照。

1.5 免疫層析法 (1)直接免疫層析法：在抽提管內加入試劑A和試劑B各5滴，將1根樣本拭子插入抽提管中，反復用力旋轉并上下抽提至少10次，靜置10 min，棄去拭子，塞緊滴頭，滴加2～3滴樣本液至試劑卡加樣孔中，10～20 min判斷結果。(2)改良免疫層析法：增菌培養18～24 h、36～48 h后，用無菌吸管各取1 mL增菌液，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入試劑A和試劑B各5滴，混勻后靜置10 min，滴加2～3滴樣本液至試劑卡加樣孔中，10～20 min判斷結果。(3)判斷標準：質控線(C)及檢測線(T)均出現紅色線條判斷為陽性，只有質控線出現紅色線條判定為陰性，只有檢測線出現紅色線條判定為無效。

1.6 PCR法 (1)直接PCR法：取1根樣本拭子并向其中加入1 mL生理鹽水，振蕩混勻后轉移至1.5 mL EP管，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入DNA提取液50 μL，100℃裂解10 min，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，取上清5 μL作為模板進行PCR擴增并判定結果。(2)改良PCR法：增菌培養18～24 h、36～48 h后，用無菌吸管各取1 mL增菌液[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min后棄上清，加入DNA提取液50 μL，100℃裂解10 min，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，取上清5 μL作為模板進行PCR擴增并判定結果。(3)判斷標準：FAM通道有擴增曲線且CT值<38判定為陽性；FAM通道有擴增曲線且CT值≥38或者FAM通道無擴增曲線且VIC通道有擴增曲線判定為陰性。

1.7 統計學分析 采用SPSS 24.0進行統計分析。計數資料以例數或百分比表示，同一患者樣本直接與改良方法的比較使用McNemar檢驗，細菌培養法、PCR法、層析法之間比較，采用行×列表χ2檢驗，以P<0.05表示差異具有統計學意義。對于樣本率的兩兩比較，采用Bonferroni法對檢驗水準進行校正，校正后的兩兩比較檢驗水準α=0.017。

2 結 果

2.1 直接細菌培養與增菌后培養法的檢測結果 直接細菌培養法陽性檢出率為2.33%(7/300)，增菌18～24 h、36～48 h后培養陽性檢出率分別為9.33%(28/300)、10.67%(32/300)。增菌18～24 h、36～48 h后培養的陽性檢出率高于直接培養(均P<0.001)，但增菌不同時間后培養的陽性檢出率比較差異無統計學意義(P=0.125)，見表1、表2及表3。

表1 直接培養法與增菌18～24 h后細菌培養法的檢測結果比較(n)

表2 直接培養法與增菌36～48 h后細菌培養法的檢測結果比較(n)

表3 增菌18～24 h與36～48 h后細菌培養法的檢測結果比較(n)

2.2 直接PCR法與增菌后PCR法的檢測結果 直接PCR法陽性檢出率為9.00%(27/300)，增菌18～24 h、36～48 h后PCR法陽性檢出率分別為12.67%(38/300)、14.00%(42/300)。增菌18～24 h、36～48 h后PCR法陽性檢出率均高于直接PCR法(均P<0.001)，但增菌不同時間后PCR法的陽性檢出率比較差異無統計學意義(P=0.289)，見表4、表5及表6。

表4 直接PCR法與增菌18～24 h后PCR法的檢測結果比較(n)

表5 直接PCR法與增菌36～48 h后PCR法的檢測結果比較(n)

表6 增菌18～24 h與36～48 h后PCR法的檢測結果比較(n)

2.3 直接免疫層析法與增菌后免疫層析法的檢測結果 直接免疫層析法陽性檢出率為5.33%(16/300)，增菌18～24 h、36～48 h后免疫層析法陽性檢出率為13.67%(41/300)、14.67%(44/300)。增菌18～24 h、36～48 h后免疫層析法陽性檢出率均高于直接免疫層析法(均P<0.001)，但增菌不同時間后免疫層析法的陽性檢出率比較差異無統計學意義(P=0.250)，見表7、表8及表9。

表7 直接免疫層析法與增菌18～24 h后免疫層析法的檢測結果比較(n)

表8 直接免疫層析法與增菌36～48 h后免疫層析法的檢測結果比較(n)

表9 增菌18～24 h與36～48 h后免疫層析法的檢測結果比較(n)

2.4 3種直接檢測法結果的比較 3種直接檢測方法陽性檢出率差異有統計學意義，其中直接PCR法的陽性檢出率高于直接細菌培養法(P<0.017)，其他方法兩兩比較差異均無統計學意義(均P>0.017)，見表10。

表10 3種直接檢測法結果的比較[n(%)]

2.5 增菌18～24 h后3種檢測法結果的比較 增菌18～24 h后3種檢測方法的陽性檢出率差異無統計學意義(P>0.05)，見表11。

表11 增菌18～24 h后3種檢測法結果的比較[n(%)]

3 討 論

GBS感染是臨床發生率較高的妊娠晚期疾病，已被證實是引起新生兒疾病和死亡的主要原因。妊娠期的臨床篩查是預防GBS感染的有效途徑[7-9]。美國疾病預防與控制中心自1996年至今共發布了3版妊娠期GBS篩查指南，我國在2010年開始發布妊娠期GBS篩查指南，指南中的直接接種細菌培養法由于對實驗設備要求不高、容易開展，被廣泛應用于各醫院[10]。但是已有文獻表明，直接接種細菌培養法陽性檢出率不高，容易出現臨床漏檢[11-12]。而采取先接種選擇性肉湯培養基再轉種血平板的方法，由于耗時長許多醫院不愿意使用，但是較多研究表明增菌后細菌培養陽性檢出率更高[13-15]。本研究結果顯示，增菌后，無論是細菌培養法、免疫層析法還是PCR法均能獲得比直接檢測更高的陽性檢出率(均P<0.05)，與上述結果相似。這提示使用選擇性肉湯培養基增菌后，確實能夠獲得更高的陽性檢出率。分析主要原因可能是直接培養法中菌種豐富，雜菌的生長覆蓋GBS的生長，加大了檢測難度[16]；其次是標本本身的GBS含量較低，檢測方法靈敏度較低則會造成漏檢，而選擇性肉湯培養基中包含有萘啶酸、多黏菌素等抗菌藥，能夠有效抑制受檢者陰道-直腸樣本中非目標菌種(多數為革蘭陰性菌)的生長，雖然對GBS也會產生輕度抑制作用，但選擇性肉湯培養基中的鏈球菌生長營養成分可同時有助GBS的生長，更利于檢出。在增菌的過程中，筆者發現有的樣本增菌18～24 h后菌液仍清亮，為避免漏檢，我們延長培養時間至36～48 h，然而增菌36～48 h后細菌培養法、免疫層析法及PCR法的陽性檢出率提高并不顯著。因此，為了縮短檢測時限、及時發出報告，增菌的時間在18～24 h為宜，沒有必要延長增菌時間。但由于樣本量較少，本研究結果也可能存在偏倚，需要加大樣本量進一步研究證實。此外，目前市場上已有商品化的GBS增菌培養基，但其價格較為昂貴，與目前大力提倡的降低醫用耗材占比的管理目標不相符；而自行配制分裝的增菌培養基方法簡單、經濟實惠且增菌質量有保證，能很好地提高GBS的陽性檢出率。因此，筆者認為有必要將選擇性肉湯培養基進行增菌18～24 h作為GBS檢測的常規步驟。

細菌培養法、免疫層析法及PCR法直接檢測樣本GBS的陽性率分別為2.33%、5.33%、9.00%，其中PCR法的陽性檢出率高于細菌培養法(P<0.017)。這是因為PCR法可以忽略細菌培養法中GBS生長的情況，而且能夠檢出非β型溶血性GBS及協同溶血試驗陰性的GBS[17]。在細菌培養及鑒定的過程中，只有可疑的菌落才有機會被挑取行協同溶血試驗及下一步的鑒定，對可疑菌落的選擇及對平板的判讀要求微生物工作者有較高的專業能力，這也是細菌培養容易造成漏檢的原因之一。而對樣本進行增菌18～24 h后,細菌培養法、免疫層析法及PCR法對GBS的陽性檢出率分別為9.33%、13.67%、12.67%，三者差異無統計學意義(P>0.05)。這可能是因為，增菌后GBS菌量增加，當待測樣本中的GBS顯著增加，超過各方法的檢測靈敏度之后，各檢測方法因靈敏度不同造成的檢測差異即縮小，最終導致三種檢測方法的陽性檢出率相似。

細菌培養法、免疫層析法及PCR法各有其優缺點。細菌培養法檢出率相對較低且對工作人員的專業能力要求較高，但因其可以進一步做藥敏試驗而被廣泛應用，通過增菌可以顯著提高細菌培養法的陽性檢出率，因此筆者認為增菌步驟對于細菌培養法很重要。PCR法靈敏度更高，只需2～3 h即可完成批量檢測，但操作相對復雜，且對實驗設施及場地要求較高，在不具備開展基因擴增實驗室的醫院無法完成。而免疫層析法雖然檢測靈敏度相對較低，但檢測方法簡單快捷，30 min左右即可完成，且僅需試劑盒及一些簡單的試驗設備，對檢測方法進行改良即檢測前對樣本進行增菌，檢測時對增菌液進行濃縮，能獲得與PCR法相似的陽性檢出率。

綜上所述，檢測前增菌18～24 h均能提高細菌培養法、免疫層析法、PCR法對GBS的陽性檢出率，且前兩種方法可獲得與PCR法相似的陽性檢出率。此外，檢測時對增菌液進行濃縮，能進一步提高免疫層析法對GBS的陽性檢出率，值得臨床推廣應用，尤其是專業人員專業能力及設備相對薄弱的基層實驗室。