幾種化學因素對海蜇毒素溶血活性的穩定效果

李偉　李紅　周宇　徐善良

摘 要：為解決在放置一段時間后海蜇（Rhopilema esculentum）毒素溶血活性銳減的問題，利用分光光度計測量了EDTA、GSH、Ca2+、NaCl等化學因素對海蜇毒素溶血活性的穩定效果。結果發現：（1）EDTA對毒素具有較好的穩定作用，濃度在0.5 mmol/L時溶血活性最高，其溶血率為93.63%;（2）NaCl對毒素也具有穩定作用，當濃度在5 mmol/L時溶血活性最高，其溶血率為92.68%;（3）GSH對毒素穩定作用較差，在濃度為0.5 mmol/L時溶血活性最高，其溶血率為58.17%;（4）Ca2+對海蜇毒素不具有穩定作用;（5）正交試驗發現，NaCl對溶血活性的穩定性影響最大，在GSH、NaCl、EDTA濃度分別為1.0、5、0 mmol/L時，海蜇毒素的溶血性最強。

關鍵詞：海蜇（Rhopilema esculentum）毒素;溶血活性;化學因素;穩定性

海蜇（Rhopilema esculentum）是一種分布廣泛的大型經濟浮游動物，隸屬于腔腸動物門（Coelenterate），缽水母綱（Scyphozoa），根口水母目（Rhizostomeae），根口水母科（Rhizostomadae），海蜇屬（Rhopilema）。海蜇在我國南北沿海均有分布，以黃、渤海及浙江省沿岸分布較多[1-2]。海蜇外部形態由兩部分所組成，即傘部和口腕部[3]。在口腕部的邊緣處長有觸指，又稱觸手，其多呈乳白色，上面有大量能放出刺絲的囊狀細胞器—刺胞，刺胞內含有大量的毒液，這些毒液稱為海蜇毒素[4-5]。當海蜇的觸手刺入人體皮膚，會迅速釋放刺胞毒中的毒素引發皮膚搔癢、水腫、肌痛、呼吸困難、低血壓、休克甚至死亡等現象[6]。海蜇不僅具有食用價值，還是一種具有特殊功效的中藥材[7]，海蜇毒素在現代醫學上具有降壓、降脂、抗氧化等作用[8]。

在洪惠馨[9]、Nagai H[10]等的研究中發現，海蜇毒素的主要成分為類蛋白、多肽、酶類毒素、四氨鉻物、強麻醉劑、組織胺、5-羥色胺等生物活性物質，同時還發現毒素發揮溶血作用主要是以相關物質對細胞膜上的離子通道、離子泵和通透性蛋白產生影響來實現的[11-12]。但是海蜇毒素在放置一段時間后活性會發生銳減。為了解決這一問題，本試驗通過研究幾種不同的化學因素對海蜇毒素溶血活性的影響，從而對海蜇毒素的保存條件進行優化，進而有利于將來對海蜇毒素的溶血活性物質、毒理作用和藥理作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 刺絲囊的分離

試驗用海蜇于2016年8月下旬采集于浙江省寧波市鄞州區一海蜇養殖場。從海蜇養殖場采集新鮮活體海蜇運送到實驗室后，使用人工手術刀片切下觸手，并用生理鹽水沖洗后迅速于-20 ℃冰箱冷凍保存。需要海蜇時將一部分先前保存的海蜇觸手取出，置于約四倍體積的無菌海水中，在4 ℃溫度下使其發生自溶，可每天用玻璃棒輕攪2～3次并進行換水加快自溶。五天后，倒掉上層清液，利用100目的濾篩過濾下層懸濁液，濾除未溶解的組織。濾液離心后收集沉淀，將沉淀重新懸浮于0.9% NaCl溶液中，在10 000 r/min的轉速下離心20 min。離心完畢后將上清液倒掉，用小勺輕輕刮去離心管中的沉淀上層（大部分為破碎的刺絲囊和觸手組織碎片），再將剩余的底層沉淀重新懸浮于0.9% NaCl溶液中，在10 000 r/min的轉速下離心，每30 s取刺絲囊觀察一次，直至顯微鏡下觀察到刺絲囊表面沒有雜質為止。將沉淀重新吹懸于0.9% NaCl溶液中，在5 000 r/min的轉速離心15 min，并用蒸餾水洗滌沉淀3～4次，冷凍后干燥，于-20 ℃冰箱保存[13]。

1.2 海蜇毒素的提取

本試驗中海蜇毒素的提取采用珠磨式組織研磨法。具體方法為：將直徑約為0.5 mm的玻璃珠和上一步中提取的刺絲囊加入小型破碎管中，加入的玻璃球和刺絲囊的體積約占破碎管總體積的一半，然后用等滲的Tris-HCl緩沖液浸沒。放置于4 ℃的冰箱內預冷1 min后，于4 600 r/min下震蕩破碎1 min，重復幾次后，將破碎液轉移到離心管中，在10 000 r/min，4 ℃條件下冷凍離心20 min，對離心后的上清液進行收集，所得的上清液即海蜇毒素溶液[14-15]。

1.3 紅細胞溶液的制備

用Tris-HCl的等滲緩沖液（pH為7.4）和肝素（約為160單位/mg）配制為一定量的肝素Tris-HCl等滲緩沖液，采新鮮雞血于容器中并加入抗凝劑，按照肝素Tris-HCl緩沖液與血液之比為1∶5的比例加入適量肝素Tris-HCl緩沖液。然后血液在4 ℃，2 000 r/min的條件下離心20 min。得到紅細胞沉淀。將上清液（即血漿）倒掉，并除去紅細胞沉淀表面的絨毛狀沉淀層，然后用三倍量的預冷的Tris-HCl緩沖液將紅細胞懸浮，后4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，刮去表層沉淀，如此重復洗滌三次，最終得到紅細胞沉淀。試驗時將紅細胞沉淀配成體積比為1% 的溶液備用[16]。

1.4 不同物質對海蜇毒素穩定性的影響試驗

試驗分為5個組，每組設置3個平行，第一組用Tris-HCl緩沖液配置一定量的EDTA，使其濃度為5 mmol/L，加入到毒素溶液中，使毒素溶液中的EDTA的濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L;第二組取一定量的NaCl用Tris-HCl緩沖液配置成50 mmol/L，加入毒素溶液中，使得其中的NaCl濃度分別為0、1.0、5.0、15、20、25 mmol/L;第三組取一定量的CaCl2用Tris-HCl緩沖液配置成25 mmol/L，加入毒素溶液中，使得其中的CaCl2濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L;第四組用Tris-HCl緩沖液將一定量的GSH（還原型谷胱甘肽）配制成濃度為25 mmol/L的溶液，取適量GSH溶液加入毒素溶液，使毒素溶液中GSH的濃度分別達到0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L;第五組為三因素四水平試驗（表1）。

1.5 溶血活性的測定

本試驗中測定海蜇毒素溶血活性的方法參考了Rottini[17]。測定海蜇毒素的溶血活性時取0.5 mL第三步中制得的紅細胞懸濁液，加入等體積的各個毒素樣品，再用等滲Tris-HCl緩沖液（pH為7.4）配至總體積為2 mL，用414 nm的紫外光測定各樣品上清液的吸光值，所得的數據即可代表溶血活性。

1.6 數據處理

將得到的數據通過SPSS13.0、EXCEL等工具進行分析，最終通過平均值±SD的方式進行表示，采用SPSS中單因子方差分析（One-way Anova）的Duncans multiple法對溶血活性進行差異顯著性檢驗（P<0.05為差異性顯著），并進行作圖。

2 結果與分析

2.1 EDTA對海蜇毒素溶血性的影響

試驗發現，毒素中加入一定量的EDTA對于毒素穩定性的增強具有一定的作用。試驗結果如圖1所示，未加入EDTA（即EDTA的濃度為0時）的海蜇毒素樣品的溶血活性為87.60%，當海蜇毒素中EDTA濃度上升至0.5 mmol/L時其溶血能力達到了最大值93.63%。隨著毒素中EDTA濃度的逐漸增大，溶血能力呈現先降低再升高的現象，但均高于未添加EDTA時海蜇毒素的溶血能力。經過顯著性分析發現，各濃度下的溶血性無顯著性差異。

2.2 NaCl對海蜇毒素溶血性的影響

試驗發現，毒素中加入一定量的NaCl能夠在一定程度上穩定海蜇毒素溶血活性。試驗結果如圖2所示，當海蜇毒素中NaCl濃度為0 mmol/L的時候，其溶血能力為77.51%。隨著NaCl的濃度增加，溶血能力也開始逐漸增強，當毒素中的NaCl濃度達到5 mmol/L時，溶血能力達到最大值92.68%;當濃度高于5 mmol/L后，毒素的溶血能力又開始下降，在濃度從5 mmol/L上升至15 mmol/L這個過程中，毒素的溶血能力也下降至78.59%;在濃度高于15 mmol/L后溶血能力下降緩慢;當濃度達到20 mmol/L后，溶血活性趨于平穩，略高于未加入NaCl的毒素的溶血活性，說明此后NaCl對于溶血活性影響不大。同時，通過顯著性分析發現，在NaCl濃度從0 mmol/L增加到1 mmol/L時，溶血活性顯著性增強，在濃度為1、5、10 mmol/L這三組間溶血活性具有差異性，但沒有顯著性增強或減弱，同時，在濃度從10 mmol/L變為15 mmol/L時，出現顯著性降低，濃度繼續增加，顯著性差異變小。

2.3 Ca2+對海蜇毒素溶血性的影響

試驗發現，毒素中加入一定量CaCl2后，海蜇毒素的溶血性基本不隨濃度的變化而變化，結果如圖3所示，基本保持在44.50%左右，整體趨于平穩，說明CaCl2對海蜇毒素的溶血活性基本不具有穩定性的作用。通過顯著性分析也發現，各濃度下的溶血活性有一定的差異性，但是各組間差異性較小，整體溶血活性較為穩定。

2.4 GSH對海蜇毒素溶血性的影響

試驗發現，毒素中加入一定量的GSH能夠在一定程度上穩定海蜇毒素溶血活性。結果如圖4所示，發現未加入GSH的海蜇毒素溶血水平為43.17%，然后隨著濃度的增加，溶血活性也逐漸增強，在濃度為0.5 mmol/L時，溶血能力達到最大值58.17%，但隨著濃度的繼續增大，溶血活性開始逐漸減弱，最終趨于平穩，但溶血活性均比未加入GSH的幾個組高。同時，通過顯著性分析發現，GSH濃度從0 mmol/L增加到0.5 mmol/L時，海蜇毒素的溶血活性有顯著性增強，其溶血活性在GSH濃度為0.5～1.0 mmol/L以內時具有差異性，但沒有顯著性增強或減弱。在濃度從1 mmol/L變為1.5 mmol/L時，出現顯著性降低，之后濃度繼續增加，顯著性差異變小。

2.5 正交試驗

試驗發現，一定量的EDTA、GSH、NaCl對海蜇毒素的溶血活性均具有一定的穩定作用，故設計三因素四水平試驗，從而得到使得海蜇毒素保持相對穩定的最佳的條件。見表1。

3 討論

海蜇毒素中含有與溶血活性相關的成分，海蜇毒素活性檢測的最好方法就是溶血活性檢測。按照相關報道，有關毒素在紅細胞中發生溶血作用主要通過以下三個步驟：（1）毒素通過溫度依賴性附著的方式附著于細胞膜上;（2）毒素通過溫度依賴性的方式穿透細胞膜，形成細胞膜空洞;（3）細胞破裂，血細胞內血紅蛋白釋放至外界[18]。馮金華[19]等的實驗發現水母毒素在4 ℃的條件下是不具有溶血活性的，但是升溫后活性可以得到恢復，所以選擇先在4 ℃的條件下進行海蜇毒素的提取。

通過正交試驗發現，不添加任何物質時，海蜇毒素的溶血活性最低，當GSH、NaCl、EDTA濃度分別為1.0、5.0、0 mmol/L的時候，其溶血活性最高。見表2。

GSH是一種小分子肽類物質，其分子結構中一般含有巰基，巰基有一定的解毒作用，因其可以與汞、鉛等的重金屬鹽形成絡合物而減少重金屬鹽與其他物質的結合，即中和毒性。解毒的同時，GSH也對蛋白質及酶分子中的巰基有保護作用，可避免其被自由基氧化而活性喪失。GSH能夠在一定程度上穩定海蜇毒素的溶血活性，可能與海蜇毒素中相關酶或蛋白質的活性中心中含有巰基有一定的關聯。

蛋白質類酶的活性在很大程度上受金屬離子的影響，因金屬離子可以作為酶分子的輔助因子，對酶的活性及專一性產生影響。同時有些金屬離子會起活化劑的作用，如Co2+、Mn2+、Mg2+等離子一般能使D-葡萄糖異構酶的活性顯著增加[20]。金屬激活酶中的酶主要與金屬離子進行松弛的結合，對酶結構的穩定性產生一定的影響，如Ca2+對胰蛋白酶、灰色鏈絲菌蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等酶具有穩定性[20]。相關研究發現，有Ca2+存在時霞水母（Cyanea sp.）毒素的溶血活性有所增強但沒有穩定毒素作用[21]，本研究發現，Ca2+對海蜇毒素的溶血活性不具有增強和穩定的作用，故推測Ca2+可能只是海蜇毒素溶血物質中的一個起到催化作用的金屬離子，不是海蜇毒素活性成分的特異性配基。

對于大多數蛋白質來說，保存在一定離子濃度的溶液中有利于蛋白質在溶液中形成非天然聚集物，因為溶液中的離子會對蛋白質中分子間電荷的相互作用產生一定的屏蔽效果[20]。據報道，Carbdea rastoni水母毒素在4 ℃下，在0.8 mol/L NaCl、5 mmol/L 磷酸緩沖液中可以保持6個月的溶血活性[22]。本試驗中，加入的NaCl也對海蜇毒素溶血活性具有一定的穩定作用。

EDTA是一種螯合劑，能與金屬離子發生螯合作用，從而使得相關金屬離子不能作為蛋白質氧化的催化劑與海蜇毒素結合。適量的EDTA加入溶液中可以結合溶液中的重金屬 （如Fe、Cu、Mn等），防止相關活性蛋白質與重金屬結合發生失活的現象[21]。所以將少量的EDTA加入到毒素中，可能是對毒素的保護產生了有利影響，使毒素活性得以保持。EDTA所發揮的作用與GSH 的作用是相似的，故在正交試驗中，在只含有5.0 mmol/L NaCl、1.0 mmol/L GSH的溶液中，海蜇毒素也可達到較大的溶血活性。

本試驗通過研究GSH、Ca2+、NaCl、EDTA等化學因素對海蜇毒素溶血性穩定性的影響，表明Ca2+對海蜇毒素的溶血性基本沒有穩定作用，GSH、NaCl、EDTA等均對海蜇毒素的溶血活性的穩定性具有一定的作用，其中NaCl的穩定作用相對較強。同時，通過顯著性差異分析，也可以發現在低濃度下濃度越大穩定性效果越好，高濃度的穩定效果差異性不大，其穩定效果都表現得較差。當毒素中GSH濃度為1.0 mmol/L、NaCl濃度為5 mmol/L時，海蜇毒素溶血性最高，即穩定效果最佳。同時通過與馮金華[21]等人對于霞水母毒素研究的對照，可以發現，兩者的刺絲囊毒素溶血性的穩定性受GSH、NaCl、EDTA等單因素影響大致相同，都是在低濃度時隨影響物質濃度的增大而具有更好的穩定效果，當影響物質達到一定濃度后若濃度再繼續增加，其穩定效果開始下降，在達到較高濃度后，對毒素的溶血活性的穩定效果趨于穩定，不再隨濃度變化而變化;Ca2+基本上對兩種毒素的溶血活性都沒有穩定作用;在正交試驗時發現，影響霞水母刺絲囊毒素溶血性的穩定性的主要因素是GSH，而影響海蜇刺絲囊毒素的則是NaCl，這可能是由于種類的差異造成的，也可能是因為試驗時冷凍保存時間的不同而造成的， 但可以發現在各組正交中兩者溶血性變化趨勢是相一致的，穩定效果的最佳結果也是相同的。兩者對比，可以說明海蜇毒素受化學條件的影響與霞水母毒素受到的影響是大致相同的，但是由于種類差別，兩者在溶血能力上有一定的差異。

4 結論

本試驗進行了海蜇毒素的提取，并研究了GSH、Ca2+、NaCl、EDTA等化學因素對海蜇毒素穩定性的影響，結果表明，GSH、NaCl、EDTA可以對海蜇毒素的穩定性具有一定的影響，而Ca2+可能僅作為催化劑，對海蜇毒素溶血活性的穩定性無影響。當毒素溶液中含有0 mmol/L EDTA、5.0 mmol/L NaCl和1.0 mmol/L GSH時，可獲得對溶血活性最佳的穩定作用。通過本次研究，得到了效果較優的穩定海蜇毒素的方案，為今后進一步進行海蜇毒素的相關研究奠定了基礎。

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The stabilizing effect of several chemical factors on the hemolytic activity of jellyfish toxin

LI Wei1，LI Hong1，ZHOU Yu1，XU Shanliang1，2*

（1.School of Marine Sciences， Ningbo University; Ningbo 315211，China;2.Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology Ministry of Education， Ningbo University， Ningbo 315211，China）

Abstract：In order to solve the problem that the hemolytic activity of jellyfish（Rhopilema esculentum） toxin decreases sharply after being placed for a period of time， the stabilizing effect of chemical factors such as EDTA， GSH， Ca2+ and NaCl on the hemolytic activity of jellyfish toxin was measured by spectrophotometer. The results indicated that： （1） The presence of EDTA benefited the stability of the hemolytic activity. The hemolytic activity was the highest when the concentration was 0.5 mmol/L， and its hemolysis rate was 93.63%. （2） NaCl also had a stabilizing effect on the toxin. When the concentration was 5 mmol/L， the hemolytic activity was the highest and the hemolysis rate was 92.68%. （3） GSH had a poor stabilizing effect on the toxin. The hemolytic activity was the highest when the concentration was 0.5 mmol/L， and its hemolysis rate was 58.17%.（4） The results showed that Ca2+ had no stabilizing effect on jellyfish toxin. （5） Orthogonal experiment found that NaCl had the greatest influence on the stability of hemolytic activity. When the concentrations of GSH， NaCl， and EDTA were 1.0， 5， and 0 mmol/L，respectively， the hemolysis of jellyfish toxin is the strongest.

Key words：jellyfish（Rhopilema esculentum） toxin; hemolytic activity; chemical factor; stability

（收稿日期：2020-08-19;修回日期：2020-09-11）

基金項目：浙江省重大科技專項項目（2019C02059）。

作者簡介：李偉（2000.03-），男，本科在讀，專業：水產養殖。E-mail： 186003051@nbu.edu.cn。

通信作者：徐善良（1962-），男，教授，研究方向：海產經濟動物健康養殖。E-mail： xushanliang@nbu.edu.cn。