熒光光譜法測定大蒜中三種含硫氨基酸與BSA間的相互作用

李星星, 張 翔, 黃雪松

暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東 廣州 510632

引 言

大蒜(AlliumsativumL.，又稱為葫蒜、葫、獨蒜等)，富含含硫氨基酸，如蒜氨酸(S-allyl cysteine sulfoxid，SACS)、脫氧蒜氨酸(S-allyl cysteine，SAC)、S-烯丙基巰基半胱氨酸(S-allyl mercapto cysteine，SAMC；見圖1)等，它們具有清除自由基、抗糖尿病等多種功效。大蒜的保健、藥用等生物學功能，應當同這些含硫氨基酸和存在于生物體內的蛋白質等生物大分子之間的相互作用有直接關系。藥物分子進入體內后與血清白蛋白結合，在體內被運輸、儲存，發揮藥用價值，常常以BSA作為模型蛋白闡明研究保健功能成分與血清蛋白之間的結合方式、結合位點等相互作用機制；這些機制的闡明，對于保健食品、藥物等產品的開發與應用，具有重要的理論指導價值。

圖1 三種含硫氨基酸的結構式Fig.1 Chemical structure of three kinds of sulfur-containing amino acids

馬雪紅[1]報道了SACS與BSA、HSA的結合作用，即在298 K下結合常數分別為9.81×102和2.27×102L·mol-1；SAC與BSA之間的作用主要為靜電引力，與HSA之間的作用主要為疏水作用力。Sun[2]等報道了SACS和HAS的結合作用，在298 K結合常數為1.58×104L·mol-1；SAC與BSA之間的作用主要為氫鍵和范德華力。由此可見，這兩種氨基酸因結構不同結合作用相差較大，而SAMC與血清白蛋白的結合作用還未見報道，同時三種含硫氨基酸因結構不同引起結合作用變化等也需要進一步闡明。為彌補這些不足，本論文擬采用熒光光譜法和紫外吸收光譜法分析三種含硫氨基酸與牛血清白蛋白的相互作用，計算其結合常數、結合作用力類型、熱力學參數、結合距離、結合位點等，以為三種含硫氨基酸的開發與利用提供相應的理論依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電子分析天平(AX205DR，METTLER TOLEDO)；熒光分光光度計(PE LS 45，美國Perkin Elmer公司)；紫外分光光度計(UV-9600，北京瑞利分析儀器公司)。SAC，SACS和SAMC均來自于實驗室化學合成(經MS，HRMS和1H-NMR確定合成的均為目標產物，純度均大于95%)；牛血清白蛋白(BSA，上海伯奧生物科技有限公司，LOT：080325)；實驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜的測定

在10 mL容量瓶中依次加入2 mL pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液、2 mL的0.50 mol·L-1NaCl溶液，6 mL濃度為3×10-5mol·L-1的BSA溶液。取3 mL該溶液與石英比色皿中，依次加入20 μL SAC，SACS(0.05 mol·L-1)，10 μL SAMC(0.05 mol·L-1)對照溶液，共加6次，混勻，得到SAC、SACS濃度分別為：(0.00，3.31，6.57，9.80，13.0，16.1，19.2)×10-4mol·L-1的BSA混合溶液，SAMC濃度即為前面兩種氨基酸的一半。最后將反應液分別在298和310 K溫度下保持5 min。在熒光分光光度計操作界面中，選擇熒光掃描模式。以280 nm為激發波長，掃描300～400 nm熒光光譜并記錄熒光強度的變化。

1.2.2 實驗數據分析

使用Origin8.5(Origin Lab Co., Northampton, MA, USA)軟件進行繪圖，Chemdraw繪制化合物的結構式；使用Microsoft Excel對數據進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 三種含硫氨基酸與BSA相互作用的熒光光譜

圖2中，在350 nm處出現了較強的熒光峰，這是BSA分子固有的內源熒光物質色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等酚型氨基酸殘基的綜合效應所發射的熒光[3]；該峰處的熒光強度變化，反映了溶劑、溶質與BSA之間的相互作用。由圖2各圖中可以看出：

(1)三種含硫氨基酸均具有熒光猝滅作用，且熒光猝滅強度大小分別為：SAMC>SAC>SACS。如在298 K時，SAMC隨著濃度的增加(a—g)熒光強度下降了362 a.u.，而SAC熒光強度僅下降了88 a.u，但高于SACS下降量43 a.u。

(2)三種含硫氨基酸的濃度越高，對BSA的熒光基團猝滅作用越強。如在298 K時，SACS樣品中隨著濃度的增加(a—g)，熒光強度從627 a.u.下降為584 a.u；SAC熒光強度從670 a.u下降為582 a.u；SAMC熒光強度從639 a.u下降為277 a.u。

(3)溫度影響三種含硫氨基酸與BSA的熒光猝滅作用。如在298 K下，SAC和SAMC的熒光強度下降量分別為88和362 a.u，在310 K的下降量分別為78和257 a.u，溫度越高下降量越少；而在同樣條件下SACS的熒光強度下降量分別為43和44 a.u，猝滅效果不佳、溫度差異引起的熒光強度的變化較小。

綜上所述，可初步判斷SACS，SAC和SAMC均具有熒光猝滅作用，SAMC的熒光猝滅作用最強。

2.2 據Stern-Volmer方程確定三種含硫氨基酸對BSA的熒光猝滅作用類型

根據Stern-Volmer方程式(1)可得熒光猝滅常數。以F0/F對[Q]作圖，得到不同溫度條件下三種含硫氨基酸對BSA的Stern-Volmer函數(圖3)，由截距求得Kq和Ksv(見表1)。

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式(1)中：F和F0分別表示有無猝滅劑時BSA的熒光強度；[Q]為猝滅劑濃度(mol·L-1)；KSV為熒光猝滅常數(L·mol-1)；Kq為雙分子猝滅速率常數[L·(mol·s)-1]；τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命(一般約10-8s)。

一般地，各類熒光動態猝滅劑的Kq最大為(1.0～2.0)×1010L·(mol·s)-1[4-5]，且常隨溫度升高稍微增加；而靜態猝滅劑的Kq則遠大于2.0×1010L·(mol·s)-1，并常隨著溫度的升高有一定程度的降低。由表1中看出：在所測條件下只有SAMC的Kq>2.0×1010L·(mol·s)-1，且隨著溫度的升高明顯降低；其他兩種氨基酸的Kq值均遠小于2.0×1010L·(mol·s)-1。而且只有SAMC的KSV隨溫度的升高明顯下降，可以再次表明SAMC對BSA的猝滅作用為靜態猝滅。而SACS的KSV隨溫度的升高都有所增加，SAC無明顯差異，則表明為動態猝滅。

因此，綜合Kq和KSV兩方面的結果，可以判斷SAMC對BSA的猝滅作用為靜態猝滅，SACS，SAC對BSA的猝滅作用為動態猝滅。

2.3 SAMC與BSA相互作用的結合常數和結合位點

靜態猝滅劑濃度[Q]、結合常數KA、熒光強度F和結合位點之間n的關系可用式(2)Lineweaver-Burk雙對數方程來表述。

lg(F0-F)/F=lgKA+nlg[Q]

(2)

式中：F0，F和[Q]含義同式(1)；KA為化合物與血清白蛋白在不同溫度下的結合常數(L·mol-1)，通過式(2)方程的截距求真數即為KA值；n為結合位點數。按式(2)分別繪制SAMC與BSA在298和310 K溫度下的～的雙對數圖(圖4)后，由其截距和斜率可以求出SAMC與BSA的結合常數及結合位點數(見表2)。

圖2 不同濃度SACS，SAC，SAMC與BSA相互作用的熒光發射光譜

圖3 不同溫度下三種含硫氨基酸的Stern-Volmer函數(a): 298 K; (b): 310 KFig.3 Stern-volmer function of three kinds of sulfur-containing amino acids at different temperature(a): 298 K; (b): 310 K

由表2看出：SAMC和BSA的結合位點數n分別為1.224 0和1.294 2，即近似形成一個結合位點，為1∶1復合物；其結合常數KA數量級>103，表明它們之間的結合力較強，SAMC在生物體內可以較好的儲存與轉運。由圖1可以看出：三種含硫氨基酸都含有相同的烯丙基和丙氨酸的結構，其差異僅是SAMC有二硫鍵結構，而SAC和SACS都沒有二硫鍵，說明SAMC上二硫鍵的存在使得SAMC與BSA的結合為靜態猝滅，即相互作用較強。

表1 三種含硫氨基酸與BSA的線性方程、相關系數及熒光猝滅常數Table 1 Linear equations, correlation coefficients and fluorescence quenching constants of three sulfur-containing amino acids and BSA

圖4 不同溫度下三種含硫氨基酸的Stern-Volmer函數

圖5 SAMC的紫外-可見吸收光譜與熒光的光譜重疊和BSA的發射光譜

表2 SAMC與BSA結合常數及結合位點數Table 2 SAMC and BSA binding constants and number of binding sites

2.4 SAMC與BSA相互作用的熱力學參數和作用力

小分子與蛋白質大分子(如BSA)的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等[6]。Ross理論[7]認為：當ΔH≥0，ΔS>0時，分子間的作用力為典型的疏水作用力；當ΔH<0，ΔS>0時主要為靜電引力；當ΔH>0，ΔS<0主要為氫鍵和范德華力。當溫度變化不大時，ΔH可看作一個常數。據此，可以判斷化合物與蛋白分子結合作用力的類型。

按式(2)可計算出不同溫度下SAMC與BSA作用的結合常數KA，298和310 K下的分別記為KA1和KA2。按式(3)和式(4)以lnKA對1/T作圖，求得SAMC與BSA的熱力學參數(見表3)，然后根據熱力學參數判斷作用力類型[8]。

ΔG=-RTlnKA=ΔH-TΔS

(3)

(4)

式中，ΔH，ΔG和ΔS分別表示焓，自由能和熵的變化，KA1和KA2分別為298和310 K下的KA，其中T1和T2分別為298和310 K。

表3 不同溫度下SAMC的熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters of SAMC at different temperatures

據表3結果：ΔG<0，即SAMC與BSA的作用(或反應)是自由能減少、自發進行的過程；它們作用的ΔH<0，ΔS>0，據Ross理論[7]可以判斷SAMC與BSA的結合作用力主要表現為靜電引力。

2.5 SAMC與BSA相互作用的結合距離[8]

對于小分子與蛋白分子結合形成絡合物，根據偶極-偶極非輻射能量轉移效率(E)即F?rster理論[9][見式(5)]，可以求出結合位置相對于蛋白質分子中發熒光基團之間的距離(r)，r越小，藥物分子越有利于被蛋白質存儲與轉運，越能發揮其藥理作用。

(5)

式(5)中，R0是能量轉移效率E為50%時的臨界距離，R0由式(6)求出

(6)

式(6)中，K為偶極空間取向因子，N為介質的折射指數，φ為給體的光量子效率，給體(蛋白)熒光發射光譜與受體(藥物)吸收光譜間的光譜重疊部分為J式(7)

(7)

式(7)中，F(λ)為熒光給體(BSA)在波長處的熒光強度，則ε(λ)為受體(SAMC)在波長處的摩爾吸收系數，能量轉移效率E可由式(8)求出。

E=1-F/F0

(8)

將1.0×10-6mol·L-1BSA熒光發射光譜和等濃度SAMC紫外吸收光譜輸入Origin8.5軟件中作圖(圖5)，按式(7)求得圖中光譜重疊部分面積。根據文獻[10]報道，色氨酸的量子產率為0.118，折射指數N取水和有機物的平均值1.366，空間取向因子K2取給體和受體各向同性隨機分布的平均值2/3。將以上各量代入式(6)中，計算臨界結合距離R0。按式(8)求得能量轉移效率E，然后根據E和R0按式(5)求得結合距離r。計算可得J=8.62×10-20cm3·L·mol-1，R0=1.17 nm，E=0.13，r=1.61 nm。當BSA發射熒光時，BSA的發射光譜與SAMC的紫外吸收光譜應有足夠的重疊，最大距離不應超過7 nm[11]。而計算結果r=1.61 nm，且0.5R0

3 結 論

通過熒光光譜法和紫外吸收光譜法研究了BSA與SAC，SACS和SAMC的相互作用，其與SAMC之間是靜態猝滅，與SAC和SACS之間則是動態猝滅；SAMC與BSA相互作用的結合位點數接近1；兩者主要以靜電引力結合的距離r=1.61 nm。其結合的熱動力學參數ΔH為-7.06 kJ·mol-1；298和310 K下的ΔG分別為-21.63和-22.21 kJ·mol-1；對應溫度下的ΔS分別為48.89和46.99 J·mol-1·K-1。這些結果也為進一步研究三種含硫氨基酸與BSA等大分子的相互作用、開發與利用提供了理論依據。