基于熒光數據計算蛋白質-配體結合常數的方程的對比及應用研究

張 靜，高 煊, 2，金 亮，王鴻輝，周細平

1. 河口生態安全與環境健康福建省高校重點實驗室，廈門大學嘉庚學院環境科學與工程學院，福建 漳州 363105 2. 廈門大學環境與生態學院，福建 廈門 361102

引 言

蛋白質作為重要的功能性生物大分子，在生物體的物質轉運、代謝轉化、催化作用、信息傳遞和免疫反應等生命活動中扮演重要角色[1]。而這些生命活動的發生大多涉及蛋白質-配體的結合作用。因此，蛋白質與配體結合作用的研究一直以來都是化學、藥學、醫學、毒理學以及生物學等多種學科領域的熱點問題。

在研究蛋白質和配體結合作用時，評價其結合作用的強弱具有重要意義。以藥物分子與生物體轉運蛋白質的結合作用為例，其結合作用的強弱直接影響藥物在生物體內的藥代動力學和藥效學特性[2]。評價蛋白質和配體結合作用強弱的重要參數是結合常數(Kb)。目前，多種分析方法可用以獲得蛋白質-配體的Kb值，如光譜分析法 (熒光、紫外-可見吸收、圓二色、核磁共振和表面等離子體共振光譜法等)及非光譜分析法如平衡透析法、親和層析法、電化學方法、等溫滴定量熱法和分子對接法等[3]。其中，熒光光譜法因其靈敏度高、方便快速及成本低的優點，被廣泛用于蛋白質和配體結合作用研究中。

利用熒光光譜法獲得蛋白質和配體的結合常數，往往是通過測定配體對蛋白質的熒光猝滅效應，并借助分析方程對熒光猝滅數據進行數學分析來得到Kb值。在該過程中，因不同函數方程的適用范圍不同，在使用時應據具體情況進行選擇。而以往大量的研究常忽視了這一問題，一些方程被不加選擇地使用，使得不同研究者對相同目標物的研究結果相異甚至大相徑庭[4]。那么，這其中必定有一些結果是存在問題的。然而，目前很少有研究透徹地對比分析不同函數方程的立腳點、適用范圍及其存在的缺陷，來幫助研究人員方便快速地選擇合適且有效的分析方程以避免錯誤的數據分析。

鑒于此，本文擬對現有且常用的用于計算蛋白質和配體結合常數的函數方程進行對比分析。一方面，通過不同方程的推導過程來明確其使用前提和適用范圍。另一方面，選取人血清白蛋白質(human serum albumin，HSA)-諾氟沙星(norfloxacin，NFX)結合反應體系作為模型，在方程的實際應用中考察選擇不適用的方程對所獲結果的影響。此外，我們還對比了不同分析方法獲得的HSA-NFX結合反應的Kb值，來評估熒光光譜法計算Kb值的可靠性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

NFX(純度>98%)和HSA(純度>96%)均購自美國Sigma-Aldrich公司。配制0.05 mol·L-1pH為7.40的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，并用其作溶劑，分別配制5.0×10-5mol·L-1的HSA儲備液及4.0×10-4mol·L-1的NFX儲備液，均置于4 ℃冰箱保存。其余試劑均為分析純，實驗用水為Milli-Q超純水(18.2 MΩ·cm)。

F-4600型熒光分光光度計(日立高新技術公司，日本)；UV-8000S紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 HSA-NFX反應體系的配制

熒光猝滅實驗體系：向一系列10 mL比色管中加入一定量HSA和NFX儲備液，并用PBS緩沖液定容至10 mL，使其中HSA濃度為5.0×10-6mol·L-1，NFX濃度分別為(0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100.0，150.0，200.0，250.0，300.0)×10-6mol·L-1。設置3組平行樣。

Job’s plot 實驗體系：樣品中固定HSA和NFX總濃度為2.0×10-5mol·L-1，設置HSA的濃度分別為(0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0，14.0，15.0，16.0，17.0，18.0，19.0，20.0)×10-6mol·L-1，NFX的濃度隨之變化。設置相應的對照組，對照組溶液中僅含與樣品組濃度相同的HSA，而無NFX。設置3組平行樣。

1.2.2 熒光光譜測定

298 K下，使用 1 cm×1 cm 石英比色皿，設置激發波長為282.0 nm，檢測HSA-NFX反應體系在290～480 nm 范圍內的熒光發射光譜，掃描速度為1 200 nm·min-1，激發、發射狹縫均為5 nm。所得熒光強度數據均利用公式S1進行內濾效應校正[4]。

1.2.3 吸收光譜測定

于298 K溫度下，掃描試液在190～450 nm范圍內的紫外-可見吸收光譜，所得數據用于HSA-NFX反應體系的熒光內濾效應校正。

2 結果與討論

2.1 熒光靜態猝滅數據分析方法的對比

熒光猝滅分為動態猝滅或靜態猝滅，其分別由猝滅劑與熒光團的激發態相互作用或猝滅劑抑制熒光團激發態的形成所產生[5]。區分靜、動態猝滅最有效的方法是測定熒光團的壽命變化。本文所討論的計算Kb值的不同方法僅針對因熒光團和猝滅劑間形成基態復合物所引起的靜態猝滅過程。因此，據熒光壽命分析判定猝滅方式為靜態猝滅后才可參考本文選擇合適的計算方法。

基于蛋白質-配體的復合物模型，并將蛋白質-配體的結合劃分為1∶1和1∶n(n≥2)結合兩類，在支持信息S2部分詳細討論分析了利用熒光光譜數據計算蛋白質和配體結合的Kb值的不同函數方程的推導過程及相應的適用條件。由討論可知，判斷假設a蛋白質-配體復合物不再產生熒光，和假設b添加的配體濃度遠大于蛋白質濃度(超過10倍)是否成立是選取適用的函數方程的前提條件。為此，我們總結了蛋白質-配體1∶1和1∶n結合時在不同情形下可選擇的分析方程，詳見表1。

2.2 不同數據分析方法在HSA-NFX熒光猝滅體系中的應用

在選取上述方程計算HSA與NFX的結合常數前，需首先確定HSA與NFX的結合比。由圖1(a)可知，經Job’s plot[6]擬合，兩條擬合線的交點處NFX的摩爾分數XNFX≈0.5，表明HSA與NFX結合的化學計量數比為1∶1。在此基礎上，進一步研究了不同濃度NFX對HSA的熒光猝滅情況[見圖1(b)]。由圖1(b)可知，當NFX的濃度大于1.0×10-4mol·L-1時，HSA的熒光即基本被完全猝滅。由此判定，在HSA-NFX體系中，S2.1所提出的假設a成立，即HSA-NFX復合物不再產生熒光。

為討論需要，選取圖1(b)中NFX濃度為0至2.0×10-5mol·L-1時的數據點進行后續分析。在此條件下，S2.1中所提出的假設b是不成立的。此時，方程(S12)是計算HSA與NFX結合常數的最優選擇，經非線性擬合得到HSA與NFX的Kb值為5.0×104L·mol-1。如計算時未考慮假設b是否成立而選取方程(S6)，則經擬合得到的Kb值為6.44×104L·mol-1，比使用方程(S12)得到的值大28.8%。

在以往較多的研究中，方程(S17)也常用以計算蛋白質-配體1∶1結合時的Kb值(即默認n=1)[7]。為對比，利用方程(S17)進行擬合分析得到Kb值為4.48×106L·mol-1，這比由方程(S12)所得值高2個數量級。這是由于：(1)方程(S17)的使用前提為假設a和b均成立，而對于本文分析的HSA-NFX體系，假設a成立而假設b并不成立；(2)利用方程(S17)擬合時，利用擬合曲線的截距計算Kb值時涉及10的次方運算，因此擬合過程中斜率n的微小變化就可引起Kb值較大的改變。在針對HSA與保泰松結合常數的研究中，利用方程(S17)擬合得到的Kb值比由最優方程或其他分析方法獲得的值約低2個數量級[4]，這也展現了方程(S17)的缺陷對所得結果產生的較大影響，佐證了上述判斷。此外，同樣默認n為1，利用方程(S24)擬合得到HSA-NFX體系的Kb值為7.43×104L·mol-1，該值比使用方程(S12)得到的值大48.6%。雖如此，利用方程(S24)計算Kb值的可靠性仍強于方程(S17)。

表1 蛋白質-配體1∶1和1∶n結合時方程的選擇Table 1 Selection of equations for 1∶1 or 1∶n protein-ligand binding processes

圖1 (a)總濃度([HSA]+[NFX])為2.0×10-5 mol·L-1時HSA-NFX體系熒光猝滅的Job’s Plot; (b)不同濃度NFX存在下HSA的相對熒光強度激發波長=282 nm，發射波長=332 nm

Ex=282.0 nm, Em=332.0 nm

綜上，在分析假設a成立的HSA-NFX熒光猝滅體系時，如直接選用基于假設b成立的方程，得到的Kb值將會存在一定的誤差；同時，應用方程時一些等價的數學變化可能會引入較大的誤差，使所得結果明顯不可靠。這提示，在應用上述方程計算Kb值時，應按照其使用條件正確選擇。然而，令人擔憂的是，數據分析時不加選擇地使用上述方程的現象仍較為普遍。因此，一些文章中報道的Kb值很可能不能真實反映蛋白質-配體間的真實親和力。

以往研究者在研究HSA與NFX的結合作用時，除了熒光光譜法，還利用表面等離子共振法、等溫滴定量熱法和親和毛細管電泳法來獲得Kb值。于此，我們對比了不同分析方法所獲得的結果(表2)。由表2可知，不同分析方法所得的HSA與NFX的Kb值主要集中在104L·mol-1這一量級。在這些分析方法中，等溫滴定量熱法通常被認為是量化結合親和力的最準確的方法之一，由其獲得的Kb值也在這一量級。文獻[5]利用熒光光譜法獲得Kb值，其數值遠遠大于其他研究的結果(約高3個數量級)。這是由于該文所設置的HSA和NFX濃度并不符合假設b，卻直接使用方程(S17)來擬合數據，放大了誤差，其所得結果的準確性值得斟酌。此外，本文所得的Kb值(5.0×104L·mol-1)與等溫滴定量熱法所得結果[(3.49～3.85)×104L·mol-1]存在一定的差異，這是由于兩種方法所檢測的結合反應過程中的表觀數據不同。熒光光譜法檢測的是HSA與NFX結合過程中HSA的熒光強度的變化，而除了與NFX的結合，還有其他不可控的因素(如NFX引起的HSA構象變化)也會影響HSA的熒光強度。因此，利用熒光光譜法所獲得的Kb值與真實值仍存在一定的差異。而等溫滴定量熱法檢測的是HSA與NFX結合過程中體系的熱量變化，在理想條件下影響實驗的因素是可控制的，因此其所得結果更為接近真實值。盡管如此，因熒光光譜法具有簡便快速、靈敏度高和成本低的優點，且還能獲得蛋白質微觀層面的信息，故在蛋白質-配體結合作用的研究中仍值得運用。當然，綜合利用多種分析方法來獲得和驗證蛋白質-配體結合的Kb值可獲得更為可靠的結果，值得推薦。

表2 不同分析方法所獲得的HSA-NFX體系的結合常數Table 2 The binding constant of HSA-NFX system obtained by different analytical techniques

3 結 論

利用熒光光譜法計算蛋白質-配體結合的Kb值時，判定假設a和b是否成立是選取用于數據處理的最優的函數方程的必要前提。如利用函數方程處理時忽略這一前提條件而選取了不適用的方程，將使計算出的Kb值偏離真實值，從而得到不可靠甚至明顯錯誤的結果。然而，在已有的利用熒光光譜法計算蛋白質和配體的Kb值的研究中，不加選擇地應用函數方程的問題仍廣泛存在。因此，我們希望本文能有助于提高研究者對這一問題的認識，從而在今后的工作中能避免因忽視該問題而獲得不可靠的數據。