土壤中抗生素檢測技術研究進展

劉爽 朱海榮 于燕萍 齊云 蘇本玉 于曉菲 商姍姍 張娟

摘要 土壤中抗生素殘留問題受到越來越廣泛的關注，抗生素含量測定的檢測技術研究亦越來越受到重視。目前國內外開發了多種土壤中抗生素檢測的方法，主要包括免疫分析法及理化分析方法，其中理化分析方法最為常用。就土壤中抗生素常用的檢測方法進行歸納總結，匯總了近年來國內外主要檢測方法的研究對象、檢出限、回收率，探討了現有方法的優缺點及存在的主要問題，并對今后土壤中抗生素的檢測技術進行了闡述與展望。

關鍵詞 土壤;抗生素;檢測技術;優缺點;存在問題

中圖分類號 X833? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）20-0009-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.003

Research Progress of Antibiotic Detection Technology in Soil

LIU Shuang，ZHU Hairong，YU Yanping et al （Shandong Institute of Product Quality Inspection，Jinan，Shandong 250100）

Abstract More and more attention has been paid to the problem of antibiotic residue in soil，and more and more attention has been paid to the detection technology of antibiotic content.At present，many methods for the detection of antibiotics in soil have been developed at home and abroad，including immunoassay and physicochemical analysis，among which the most commonly used methods are physicochemical analysis.This paper summarized the common detection methods，summarized the research object，detection limit and recovery rate of the main detection methods at home and abroad in recent years，discussed the advantages and disadvantages of the existing methods and the main problems existing，and expounded and prospected the detection technology of antibiotics in soil in the future.

Key words Soil;Antibiotics;Detection technology;Advantages and disadvantages;Existing problem

抗生素作為一類抗菌性藥物廣泛用于預防和治療人類、動物疾病，并且在畜牧和水產養殖業中用于促進動物的生長 [1]。有研究表明，環境介質中抗生素含量與人口密度呈正相關 [2]，而且進入人或動物體內的抗生素有60%～90%以原藥及代謝產物的形式通過糞尿排出體外，進入環境中 [3]?？股貧埩暨M入土壤環境后

經過一系列物理化學過程可被某些植物吸收富集 [4]。已有文獻證明，某些農作物可吸收累積抗生素，如Liu等 [5]研究了多種抗生素對水稻、黃瓜和莜麥的生長抑制作用，發現四環素類（TCs）和磺胺類（SAs）能夠顯著抑制農作物的發芽率;Chung等 [6]研究發現四環素、 恩諾沙星和磺胺噻唑可以被蘿卜的根和葉從土壤中吸收，從而延緩了蘿卜的生長。大量的抗生素及其生物活性代謝產物或降解產物通過施肥和灌溉引入土壤?？股氐沫h境污染已變得越來越嚴重，給農業生態系統帶來了巨大的風險 [7]。

因此，對土壤中抗生素殘留的檢測非常重要，有必要對目前土壤中抗生素檢測技術研究進展情況進行總結分析，闡明現階段的常用檢測技術，為其風險評價奠定基礎。筆者對土壤中抗生素檢測方法進行對比分析，并對現使用的檢測方法進行總結分析，以期促進土壤中抗生素檢測方法的進一步開發與應用。

1 土壤中抗生素的來源及種類

1.1 來源

自然界中的動植物、微生物在其活動過程中也能夠分泌極其少量的抗生素，但并不足以對生態環境產生影響 [8]。農業土壤中抗生素的潛在來源是廢水灌溉和施肥 [9]。廢水中抗生素的來源包括生活污水、醫院和藥廠廢水、畜禽和水產養殖業廢水等 [10]。施肥引入的抗生素來源包括糞肥、城市污泥堆肥和商品有機肥。畜禽糞肥或其堆制的有機肥中普遍含有抗生素 [11];城市污泥的處理方式之一就是經堆肥后作為有機肥農用 [12]，城市污泥中亦存在抗生素殘留的現象;商品有機肥的應用也會增加土壤中抗生素 殘留 [13]。

1.2 主要種類

目前存在的天然抗生素和合成抗生素有上萬種 [14]，主要分為磺胺類抗生素、喹諾酮類抗生素、四環素類抗生素、大環內酯類抗生素、β-內酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗生素、林可酰胺類及糖肽類等多個種類 [15]。在土壤中研究較廣泛的有磺胺類抗生素、喹諾酮類抗生素、四環素類抗生素、大環內酯類抗生素、β-內酰胺類抗生素5類。其中，磺胺類抗生素具有效價高、毒性小、抗菌譜廣、使用簡便等優點 [16]，是養殖業中常用獸藥之一;四環素類抗生素抗菌范圍廣泛，且價格便宜，成為養殖業使用量最多的抗生素種類，隨尿液、糞便排出體外，然后以糞肥形式施入土壤。因此，磺胺類和四環素類抗生素成為土壤中檢出率較高的抗生素種類。

2 土壤中抗生素殘留檢測技術

國內外對環境介質中抗生素的檢測方法主要包括微生物檢測法、免疫分析法和理化分析法 [17];理化分析方法主要包括薄層色譜法、毛細管電泳法、液相色譜法和液質聯用法 [18]。根據國內外近幾年的相關研究報道，微生物檢測法被廣泛用于牛乳抗生素檢測，其主要原理是在樣品中加入一定量抗生素，利用抗生素對特異微生物生理機能和繁殖代謝的抑制作用對樣品中抗生素定性定量 [17]，在土壤中抗生素的應用鮮見報道。土壤中抗生素的檢測方法主要有免疫分析法、毛細管電泳法、液相色譜法和液質聯用法，其中應用最廣泛的為液質聯用法。

2.1 免疫分析法

免疫分析法且具有快速、簡單和直觀等特點 [14]，且具有可現場檢測的優勢。但該方法通常存在精確性和重現性較差的問題，主要用于農產品及食品中的快速篩查 [18]，應用于土壤中抗生素檢測的報道較少。

韋薇 [19]基于碳納米管免疫新方法，建立了慶大霉素抑制曲線，可用于檢測水、土壤等介質中慶大霉素的檢測，檢測限（IC 90）為? 0.048 ng/mL，線性范圍（IC 80～IC 20）為0.080～0.512 ng/mL，回收率為 74.3%～126.8%，RSD<13.2%。相對于常用的理化方法來說，該方法的樣品處理過程簡單，但該類方法開發周期較長。

2.2 理化分析法

目前，理化檢測法廣泛用于環境中抗生素痕量檢測 [17]。理化檢測法具有靈敏度高、檢測限低、重現性好等優點，但其前期處理步驟繁雜 [14]?，F階段使用的毛細管電泳法、液相色譜法和液質聯用法，在進行檢測前樣品必須經過預處理過程，將目標物提取、純化后進行檢測。

2.2.1 樣品前處理。

常用的樣品前處理方法包括索氏提?。⊿E）、機械振蕩法（MSE）、超聲提?。║AE）、加速溶劑萃?。ˋSE）、微波輔助萃?。∕AE）、超臨界萃?。⊿FE）、QuEChERS、固相萃?。⊿PE）、固相微萃?。⊿PME）等方法。通過對近年土壤中抗生素常用檢測方法所使用的前處理方法匯總分析，發現SE、SFE和SPME方法鮮見報道，其他方法有所應用 [20-57]。為提高檢測效果、減少雜質干擾，通常會將其中2種或多種聯用進行樣品前處理。

機械振蕩法（MSE）主要是將土壤樣品與溶劑混合后，采用振蕩儀連續長時間振蕩，使溶劑與土壤樣品內部充分混合，進而提取其中的有機物殘留成分 [58]。該方法耗時長、提取效率低。如劉虹等 [20]對水、沉積物及土壤中氯霉素和3種四環素類抗生素的研究中使用了該方法，其方法回收率 較低。

超聲提?。║AE）是一種比較常用的固液萃取技術，其主要是通過產生快速機械振動波來削弱提取物與土壤基質之間的作用力，從而實現提取物與土壤分離 [58]。該方法是目前國內外最常用的提取方式之一，常與固相萃取法聯合 使用。

加速溶劑萃?。ˋSE）也叫加壓液相萃?。≒LE），該方法適用于提取固體，特別是干燥的、含有小顆粒的固體樣品中的有機物，它利用高溫高壓增加物質的溶解度和擴散效率，達到加速提取的目的 [58]。在開發該方法時，必須優化幾個參數，如溫度、壓力、靜態時間、循環數以及萃取溶劑的性質，其中溶劑是最影響萃取效率的參數 [59]。該方法對環境樣品和食品中的多氯聯苯、多環芳烴、有機磷/氯、農藥和除草劑等的萃取已經非常成熟 [21]，不適合遇熱不穩定化合物，且技術設備昂貴，目前國內在土壤抗生素的檢測中應用正在開展，國外應用相對較多。國內馬珊珊等 [31]等建立了加速溶劑萃取-固相萃取的前處理方法對土壤中青霉素及逆行檢測，其方法回收率為73.1%～89.7%;國外Salvia等 [22]建立了改良的加速溶劑萃取- QuEChERS的前處理檢測土壤中磺胺嘧啶、磺胺噻唑等9種抗生素，提高了部分抗生素如磺胺嘧啶、磺胺噻唑等磺胺類的回收率，回收率在73%～102%，均取得了良好的檢測效果。

微波輔助萃?。∕AE）是通過內加熱由內向外均勻地、迅速地將樣品進行加熱，可在極短的時間內將樣品與溶劑升高至很高的溫度，從而加快萃取效率，實現樣品與化合物的快速分離 [15]。但該方法用于熱不穩定性化合物可能會導致其分解，目前國內對該方法在土壤抗生素檢測技術中的應用較少，國外使用較多。ukaszewicz等 [48]使用微波輔助萃取-固相萃取前處理方式，電噴霧電離源（ESI）-三重四極桿質譜儀檢測了四環素、土霉素、金霉素的含量，回收率在73.3%～128.0%，對抗生素具有良好的提取效果。

QuEChERS 是Quick、Easy、Cheap、Efective、Rugged、Safe 的縮寫，即快速、簡單、經濟、高效、穩定、安全，是由美國的 Anastassiades 等 [60]開發的一種最初應用于果蔬中農藥殘留的前處理方法。該方法步驟可以簡單歸納為：乙腈提取;加入鹽類分層;加入無水硫酸鎂除水，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基建和硅膠（C 18）、石墨化碳黑（GCB）等吸附劑凈化除雜;取上清液進行檢測 [15]。目前，該方法在農藥殘留中應用較廣泛，在土壤中抗生素的檢測逐步開展。Chung等 [47]利用QuEChERS方法檢測了土壤中四環素、恩諾沙星和磺胺噻唑，回收率在77.1%～114.8%，該方法快速有效。

固相萃?。⊿PE）是一種基于液相色譜理論，利用選擇性吸附和洗脫進行物質分離，是樣品前處理中應用最廣泛的一種凈化方式。目前，該方法與超聲萃取相結合的前處理方式即超聲萃取-固相萃取的前處理方法在國內土壤中抗生素檢測中應用最為廣泛。范菲菲等 [29]使用超聲萃取-固相萃取的前處理方法檢測了土壤中土霉素的含量，回收率在 70.5%～128.8%，能夠滿足檢測需求。

固相微萃?。⊿PME）是一種集采樣、萃取、富集、進樣于一體，以達到快速、便捷、成本低以及樣品量少的目的的前處理技術 [61]。目前該技術發展迅速，在水體中抗生素的檢測中已有應用，但在土壤抗生素的研究鮮見報道。

目前國內外最常用的前處理方法為超聲萃取-固相萃取聯合使用的技術，加速溶劑萃取-固相萃取、微波輔助萃取-固相萃取及QuEChERS前處理方法的應用次之 [20-57]。以上方法的單獨使用或聯合使用并不能分離出樣品中的陽離子物質，由于土壤中存在大量共萃取的天然有機物和多價陽離子，在用質譜進行檢測時，會對四環素類抗生素產生影響 [23]，目前有報道采用強陰離子交換柱與固相萃取柱串聯的方式進行純化 [22]，可以減少質譜檢測中的基質效應，如Hu等 [24]開發的土壤中氟喹諾酮類、四環素類和磺酰胺類抗生素檢測方法中使用強陰離子交換柱，可以吸收土壤提取物中的陰離子腐殖質顆粒，從而減少了基質干擾。

2.2.2 檢測方法。

2.2.2.1 毛細管電泳法。毛細管電泳法是近年來發展比較迅速的一種分析方法。毛細管電泳是以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據樣品中各組分之間淌度（單位場強下離子的遷移速率）和分配行為上的差異而實現組分分離的技術，毛細管電泳使用毛細管柱，在pH>3的情況下，其內表面帶負電，與溶液形成雙電層，在高電壓作用下，根據正負離子和中性粒子的遷移速度不同、流出毛細管柱的時間不同從而實現分離 [62]。

左艷麗 [21]通過加速溶劑萃?。ˋSE）-毛細管電泳檢測（配有二極管陣列檢測器）土壤和底泥中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺間二甲氧基嘧啶3種磺胺類藥物殘留的方法，結果發現，其線性范圍為0.6～100.0 μg/mL，定量限（LOQ， S/N=10）為0.056～0.070 mg/kg，平均回收率在 82%～103%，RSD≤4.3%。李興華等 [25]采用固相萃?。⊿PE）純化、富集，高效毛細管電泳（HPCE）（配有紫外光譜檢測）同時測定土壤樣品中13種抗生素的含量，結果發現，其線性范圍均在 150 μg/L 以內，檢出限（S/N=3）在0.40～1.0 μg/L，回收率在 78.5%～107.0%。使用該方法檢測出養殖場土壤樣品中的磺胺嘧啶和磺胺噻唑。

毛細管電泳法在醫藥領域應用較為廣泛，近年來在環境介質中抗生素的檢測應用開始有所報道。該方法具有操作簡單、分離效率高、分析速度快、操作模式多、試驗成本低等優點 [25]，但在超低流量情況下靈敏度不高，因此常與紫外檢測器、熒光檢測器、質譜儀聯用，以提高該方法在低流量情況下的靈敏度，降低檢測限 [14]。

2.2.2.2 液相色譜法。

液相色譜法在有機化學、環境監測、生物、食品、醫學等領域廣泛應用?？股貦z測方法中液相色譜法常以C 18或相似的反相色譜柱為固定相，以甲醇、乙腈、水、甲酸溶液、乙酸銨溶液等溶劑為流動相，將多種抗生素進行分離。該方法是抗生素殘留分析的一種重要檢測手段，其檢測器類型包括紫外檢測器、二極管陣列檢測器、熒光檢測器、示差檢測器和蒸發光檢測器等。在土壤抗生素的檢測方法中，常用檢測器為紫外檢測器 [20，27-30，32，34]、二極管陣列檢測器 [31]和熒光檢測器 [26，33]，其中國內常用的檢測器為紫外檢測器，國外常用的檢測器為熒光檢測器 [26，33]。從檢出限來看，使用熒光檢測器的檢出限更低，如Speltini等 [26]研究的從土壤中檢測恩諾沙星（ENR）和達諾沙星（DAN）及2種主要光轉化產物（PTP）的方法中使用了熒光檢測器，雖未報道詳細檢出限，但其線性范圍為μg/L級（2～200 μg/L）;而楊曉蕾等 [27]研究的土壤中恩諾沙星等 10種獸用抗生素檢測方法中使用了紫外檢測器，其線性范圍為mg/L級（0.1～ 10.0 mg/L），說明熒光檢測器對喹諾酮類抗生素恩諾沙星的檢測濃度更低。熒光檢測器在檢出限方面具有更大的優勢。

2.2.2.3 液相色譜-質譜聯用法。

目前，土壤中抗生素的檢測技術主要為液相色譜-質譜聯用法。液質聯用結合了液相色譜對復雜基體化合物的較高分離能力以及質譜所具備的獨特的選擇性、靈敏度、相對分子量和結構信息于一體，現在廣泛被應用于生物、食品、醫藥等行業 [63]。質譜儀中常用的離子源有電子轟擊離子源（EI）、電噴霧電離源（ESI）、大氣壓化學電離源（APCI）等。EI 離子源屬于硬電離技術，是氣相色譜-質譜聯用儀中常用的離子源;ESI 離子源與APCI離子源屬于軟電力技術，主要應用于液質聯用，可用于分子量大、不易汽化和熱穩定性差的樣品分析 [64]。質譜儀中最核心最重要的部分是質量分析器。常見的分析器基本類型有四極桿、離子阱、飛行時間、磁偏轉和離子回旋共振。

通過總結近年來國內外土壤中抗生素檢測的液質聯用方法研究成果，可見液質聯用方法所使用的離子源有ESI、APCI，其中ESI為最常用離子源;質量分析器有單四極桿、離子阱和三重四極桿，其中三重四極桿最常用 [22-24，35-58]。

ESI與APCI這2種離子源是傳統大氣壓離子化技術的代表 [65]。ESI 技術是一種突破了離子的生成只能依賴樣品的氣化質譜技術，可以使非揮發性和熱不穩定性的化合物形成離子，既可以檢測小分子化合物，也可以測定極性強、熱穩定性差的生物大分子，如核酸、蛋白質、多肽等 [66]。大部分抗生素不易揮發，在其檢測技術中常使用ESI的離子源 [22-24，35，37-58]。朱秀輝等 [57]采用電噴霧電離源（ESI）-三重四極桿質譜對土壤中四環素、土霉素和金霉素進行檢測，結果發現回收率為70.43%～96.79%，檢出限為0.03～ 0.13 μg/L。APCI的離子化效率接近 100%，不易形成多電荷分子碎片，質譜圖相對簡單，其主要用于易揮發、熱穩定、低極性和半極性的小分子化合物的分析 [67]。該方法應用較少，Schlüsener等 [36]使用了APCI離子源-三重四極桿質譜對土壤中放線菌、頭孢菌素等9種抗生素進行檢測分析，結果發現回收率為43%～94%，檢出限為0.2～1.6 mg/kg，相對于ESI離子源-三重四極桿質譜的檢測方法，檢出限高。

三重四極桿與單四極桿相比，其定性更準確、靈敏度和分辨率更高;與離子阱相比，選擇性強、定量更準確。因此，在抗生素檢測中多使用三重四極桿的質量分析器。近年來，有科研人員開發了四極桿和線性離子阱的聯用質譜（ Q -trap），這種質譜既具有三重四極桿質譜的高選擇性和高靈敏度，又具有離子阱強大的全掃描能力 [68]，但這種質譜在藥物分析領域應用較為廣泛，在土壤中抗生素的檢測中鮮見 報道。

與液相色譜法、毛細管電泳法相比，液質聯用方法具有定性更準確的優勢。在定量方面，如表1中所示各典型檢測方法的檢出限，液質聯用的檢出限比使用紫外檢測器的液相色譜法與毛細管電泳法的檢出限低，與使用熒光檢測器的液相色譜法檢出限相當。

液質聯用檢測時易受到基質效應的影響，一方面，土壤樣品的基質會極大地影響分析物信號或增強背景噪音，影響的程度與共提取組分的濃度和質子化水平有關 [69]，另一方面，由于土壤之間的特性差異很大，不同土壤樣品的基質效應值是不同的 [37]。因此，在使用液質聯用進行檢測時，通常需要對基質效應進行評估，采用基質加標的方式進行檢測。

目前，土壤中研究較多的抗生素種類包括磺胺類、喹諾酮類和四環素類 [20-57]，其中檢出種類較多的是四環素類和磺胺類。有研究表明，四環素類抗生素檢出率高 [53，70-71];土壤中磺胺類抗生素磺胺嘧啶（SDM）在土壤中具有很高的穩定性，不易降解 [35];土壤吸附的氟喹諾酮類本身易于光降解 [26]，土壤中喹諾酮類抗生素檢出較少。

3 結論與展望

目前，土壤中抗生素的檢測方法主要是采用超聲萃取-固相萃取、加速溶劑萃取-固相萃取、微波輔助萃取-固相萃取或QuEChERS前處理技術，使用液相色譜或液質聯用進行定量測定，尤其是液質聯用法，是目前土壤中抗生素的重要檢測技術。

土壤樣品基質復雜，前處理工作繁瑣，目前仍要為改善抗生素前處理技術開展更多的研究工作。近年來新興的固相微萃取技術可逐步應用到土壤抗生素檢測技術中，將萃取、富集等集于一體，提高前處理效率，保障方法的重復性。

近年來，毛細管電泳-質譜聯用法、拉曼光譜法、免疫分析法發展迅速，也可應用到土壤抗生素的檢測技術中。多種分析技術聯用是分析化學的重要發展方向，可將不同技術優點進行集合、優化，縮短檢測時間，提高檢測靈敏度，如對于常用的液質聯用技術，結合不同質量分析器的優勢，將不同的質量分析器聯用可以達到更佳的檢測效果，建立同時檢測抗生素的高通量篩選方法，達到多種抗生素同時檢測的需求，為土壤中抗生素殘留風險分析奠定基礎。

抗生素環境污染問題事關人身安全，是重大的民生和公共安全問題。目前，國家環境保護部正在將抗生素污染納入管控范圍，以控制由此帶來的環境風險?？股睾繖z測技術作為風險評價及防控的基礎，將迎來更快、更準確且同時檢測的快速發展進程。

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