干燥綜合征基因差異譜的生物信息學分析

蔡鑫 唐芳 馬武開 蘭維婭 蔣總 樊梅 金澤旭

【摘 要】目的：應用生物信息學方法研究干燥綜合征的差異基因，為干燥綜合征的治療提供新靶點。方法：在GEO數據庫中下載并篩選干燥綜合征相關的差異表達基因，利用STRING在線數據庫構建蛋白與蛋白相互作用關系網絡，運用Cytoscape軟件篩選出關鍵基因，通過DAVID數據平臺對差異基因進行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。結果：通過分析基因芯片GSE127952后獲得406個差異基因，篩選出STAT1、MX1、IFIT1、IFIT3、ISG15等10個關鍵基因;GO分析顯示差異基因主要富集在正向調節細胞因子產生、淋巴細胞分化、T細胞活化等生物學過程;KEGG分析主要涉及細胞因子與細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路等。結論：上述所得的關鍵基因和信號通路可能與干燥綜合征的疾病過程相關，為深入研究靶向治療干燥綜合征提供了理論參考。

【關鍵詞】 干燥綜合征;差異基因;生物信息學;分子機制

【ABSTRACT】Objective：To study the differential genes of Sj?gren's syndrome by bioinformatics，and to provide a new target for the treatment of Sj?gren's syndrome.Methods：The deferentially expressed genes related to Sj?gren's syndrome were downloaded and screened from the GEO database.The protein-protein interaction network was constructed by STRING online database.The key genes were screened out using the software of Cytoscape.The enrichment analyses of GO and KEGG for differential genes were carried out using DAVID data platform.Results：Four hundred and six deferentially expressed genes were obtained by analyzing gene chip GSE127952，and 10 key genes?including STAT1，MX1，IFIT1，IFIT3 and ISG15 were screened out.Go analysis showed that the differential genes were mainly concentrated in biological processes such as positively regulating cytokine production，lymphocyte differentiation and T cell activation.KEGG analysis mainly involved the interaction between cytokines and cytokine receptors，chemotactic factor signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，T cell receptor signaling pathway，etc.Conclusion：Above key genes and signal pathways may be related to the disease process of Sj?gren's syndrome，which provides a theoretical reference for further research on the targeted treatment of it.

【Keywords】 Sj?gren's syndrome;differential gene;bioinformatics;molecular mechanism

干燥綜合征（Sj?gren's syndrome，SS）是一種慢性自身免疫性疾病，病變累及的靶器官主要包括淚腺、唾液腺等外分泌腺體。SS可根據是否合并其他風濕病分為原發性干燥綜合征（primary Sj?gren's syndrome，pSS）與繼發性干燥綜合征（secondary Sj?gren's syndrome，sSS），SS患者臨床表現多樣，除了具有典型的癥狀如口干、眼干等，也可出現多系統損害，如疲乏、肌肉關節疼痛、皮疹反復發作[1]。目前，本病的發病機制尚不明確，亦無特效藥物治療，臨床中主要通過對癥處理和替代療法緩解癥狀、改善病情[2]。生物信息學屬于生命科學范疇的一門新興學科，近年來為理解疾病發生的分子機制和開展基礎研究帶來了可供選擇的思路及可能的理論依據[3]。本研究應用生物信息學方法，對GEO數據庫中pSS患者與健康志愿者小唾液腺組織的基因芯片進行分析，篩選獲得與疾病相關的差異表達基因，對差異基因進行富集分析，構建蛋白-蛋白相互作用（PPI）關系網絡，識別pSS發生、發展的關鍵基因，為進一步研究其發病機制提供生物信息學理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料 借助NCBI中Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫收集pSS相關的基因表達譜芯片，獲得的芯片編號為GSE127952。該芯片基因數據包括8例pSS患者和6例健康志愿者的小唾液腺組織。

1.2 篩選pSS差異表達基因 在GEO數據庫中下載基因芯片編號為GSE127952的原始數據文件和編號為GPL20995-16144的芯片注釋文件。借助R軟件篩選出差異表達基因并繪制火山圖，篩選條件為P < 0.05、|log2FC|≥1.5（其中|log2FC|≥1.5為上調基因，|log2FC| < 1.5為下調基因）。

1.3 PPI分析 將篩選出的差異基因導入STRING在線數據庫，構建PPI關系網絡（得分 > 0.4分），然后下載TSV格式的PPI數據包，運用Cytoscape軟件對中心度值（Degree）≥10的基因進行可視化分析，利用插件CytoHubba分析獲得前10個關鍵差異基因[4]。

1.4 差異表達基因的富集分析 借助DAVID分析平臺對差異基因做基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，利用R軟件對富集結果進行可視化處理。

2 結 果

2.1 差異基因的篩選 利用R軟件分析pSS患者和健康人小唾液腺組織基因譜芯片，得到差異表達基因406個，包括上調基因226個和下調基因180個。繪制差異表達基因火山圖，見圖1。

2.2 構建PPI網絡和篩選關鍵差異基因 利用STRING數據庫對406個差異基因構建PPI網絡，將Degreee≥10的基因導入Cytoscape軟件進行可視化分析，該PPI網絡包含99個節點、1101條邊，網絡中節點大小由Degree值決定，節點間相互連線（邊）粗細代表連邊緊密度，中心度以冷色至暖色表示，見圖2。使用Cytoscape的插件CytoHubba篩選獲得關鍵的差異基因，包括STAT1、MX1、IFIT1、IFIT3、ISG15、GBP1、IFIT2、RSAD2、IFI44L、DDX60，見圖3。

2.3 差異基因的GO和KEGG富集分析 為研究差異表達基因在pSS中的作用機制，將上述獲得的差異基因導入DAVID數據庫進行GO和KEGG富集分析[5]。GO主要涉及對病毒反應、正向調節細胞因子產生、淋巴細胞分化等生物學過程，參與質膜外側、收縮纖維、肌節等細胞組分（CC），參與趨化因子受體結合、細胞因子受體結合、肌動蛋白結合等分子功能（MF），見圖4。KEGG主要富集在細胞因子與細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路、Toll樣受體（TLRs）信號通路等信號通路，見圖5。

3 討 論

SS是一種自身免疫性系統性疾病，而非口干、眼干的單一性疾病。目前，治療SS的隨機對照臨床試驗研究結果不盡相同，用藥尚缺少高級別循證醫學證據支撐，臨床中更多為經驗性用藥[6]。因此，從多靶點和多通路的研究角度出發，深入對SS發病機制的探索以發現潛在的治療新靶點，具有重要意義。本研究應用生物信息學方法，通過對pSS患者和健康人小唾液腺組織的基因芯片進行挖掘，共得到406個差異表達基因，對這些差異基因進行PPI分析并篩選出關鍵基因，最后進行GO和KEGG富集分析，以期為深入研究SS發病機制提供理論參考。

通過對差異基因PPI網絡的分析，獲得的關鍵基因包括STAT1、MX1、IFIT1、IFIT3、ISG15、GBP1、IFIT2、RSAD2、IFI44L、DDX60。STAT1在α/β-干擾素（IFN-α/β）、IFN-γ等細胞因子激活下被磷酸化，進入細胞核促進靶基因轉導，參與細胞分化、生長、凋亡，以及調節免疫系統等生物學功能[7]。STAT1活化后可引起活性氧累積，損傷細胞功能和結構，導致肺纖維化、動脈粥樣硬化及高血壓等[8]。pSS相關的間質性肺病患者血清中活性氧明顯增多[9]，可能在肺纖維化形成過程中具有重要生物學作用。研究發現，STAT1在pSS患者外周血單核細胞中的表達較正常人明顯升高[10]。MX1是基于IFN抗病毒反應的主要介質，受Ⅰ型IFN的調節，MX1基因表達與疾病活動有關，可能作為其潛在的生物標志物，病情活躍的pSS患者具有更高水平的MX1[11]。IFIT1、IFIT2、IFIT3同屬于IFN誘導蛋白家族，能夠抑制病毒復制，參與調節細胞凋亡和天然免疫通路[12-13]。

ISG15是由IFN刺激基因編碼的蛋白，參與抗病毒免疫反應、RNA剪接、修復染色體等多種生理過程，通過調節IFN水平或直接作用于病毒蛋白而發揮抗病毒作用[14]。GBP1主要涉及抗腫瘤和抵抗病原微生物[15]，RSAD2可作為類風濕關節炎的預測因子，是一種有著廣泛活性的抗病毒基因[16]。本研究篩選出的關鍵差異基因主要涉及抗病毒感染和調節免疫方面，SS的發病與病毒感染引起自身免疫反應相關[17]，這些基因可能有助于進一步理解病毒感染在SS中的作用機制，為本病的治療提供新思路。

借助DAVID分析平臺對上述差異基因進行GO和KEGG富集分析，結果顯示，GO主要涉及抗病毒、正向調節細胞因子產生、淋巴細胞分化等生物學過程，參與質膜外側、收縮纖維、肌節等細胞組分，參與趨化因子受體結合、細胞因子受體結合、肌動蛋白結合等分子功能。以上涉及的生物學過程與病毒感染和免疫系統反應關系密切。當前的研究認為，病毒感染和免疫功能紊亂參與了SS的疾病過程[18-19]。上述生物過程及分子功能與免疫系統功能密切相關，而免疫系統功能的異常導致了RA的發生、發展。KEGG主要富集在細胞因子與細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路及TLRs信號通路等信號通路。pSS患者的免疫性炎癥反應受細胞因子調控，這些細胞因子的異常表達可能影響疾病發生、發展，包括T細胞因子、IFN、白細胞介素（IL）、趨化因子等。IFN-γ能誘導SS患者唾液腺組織中細胞因子IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）異常表達，TNF-α分泌又能刺激唾液腺局部炎癥細胞浸潤，加重腺體破壞[20-21]。趨化因子與受體相互作用可誘導炎癥反應和淋巴樣細胞的聚集，使SS的外分泌腺體被淋巴細胞浸潤并形成異位生發中心，趨化因子CXCL13、CXCL9等在SS患者唾液腺組織中的表達明顯增多[22]，CXCL10或許能成為早期診斷SS的生物標志物[23]，趨化因子與疾病進展密切相關，進一步探索其生物學特點有助于闡明SS發病機制，使用抗趨化因子的治療方法可能減少異位生發中心形成和降低淋巴細胞的浸潤程度。TLRs可表達在巨噬細胞等免疫細胞和成纖維細胞等非免疫細胞中，能夠對抗病原微生物誘發的免疫應答[24]。TLR4、TLR7、TLR9等在pSS患者中的表達明顯高于健康人[25]。TLRs可識別細胞在損傷以及修復過程中所釋放出的內源性因子，說明其是誘導pSS發生的重要因素。TLRs能夠刺激IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子釋放，引起過度的炎性反應，進一步加重SS病情。

綜上所述，本研究應用生物信息學方法深入挖掘pSS基因表達譜芯片，篩選獲得關鍵差異基因，可能作為其潛在的靶點蛋白;通過對差異基因進行GO和KEGG富集分析得出的結果有助于提高對pSS分子機制的理解，為今后進一步的基礎研究提供可能的理論參考和新思路。由于本研究樣本量有限，所得結果可能存在偏倚;今后研究應增加樣本量，進一步探討與SS疾病過程相關的差異基因。

參考文獻

[1] FISHER BA，JONSSON R，DANIELS T，et al.Standardisation of labial salivary gland histopathology in clinical trials in primary Sj?gren's syndrome[J].Ann Rheum Dis，2017，76（7）：1161-1168.

[2] D?RNER T，POSCH MG，LI Y，et al.Treatment of primary Sj?gren's syndrome with ianalumab （VAY736） targeting B cells by BAFF receptor blockade coupled with enhanced，antibody-dependent cellular cytotoxicity[J].Ann Rheum Dis，2019，78（5）：641-647.

[3] BIAN Q，CAHAN P.Computational tools for stem cell biology[J].Trends Biotechnol，2016，34（12）：993-1009.

[4] DA FONSECA-PEREIRA P，NERI-SILVA R，CAVALCANTI JHF，et al.Data-Mining Bioinformatics：Connecting Adenylate Transport and Metabolic Responses to Stress[J].Trends Plant Sci，2018，23（11）：961-974.

[5] CHEN YJ，CHANG WA，WU LY，et al.Systematic analysis of differential expression profile in rheumatoid arthritis chondrocytes using next-generation sequencing and bioinformatics approaches[J].Int J Med Sci，2018，15（11）：1129-1142.

[6] CARSONS SE，VIVINO FB，PARKE A，et al.Treatment guidelines for rheumatologic manifestations of Sj?gren's syndrome：use of biologic agents，management of fatigue，and inflammatory musculoskeletal pain[J].Arthritis Care Res，2017，69（4）：517-527.

[7] BATHIGE SDNK，UMASUTHAN N，GODAHEWA GI，et al.Molecular insights of two STAT1 variants from rock bream （Oplegnathus fasciatus）and their transcriptional regulation in response to pathogenic stress，interleukin-10，and tissue injury[J].Fish Shellfish Immunol，2017，69（2）：128-141.

[8] SHEN L，ZHOU T，WANG J，et al.Daphnetin reduces endotoxin lethality in mice and decreases LPS-induced inflammation in Raw264.7 cells via suppressing JAK/STATs activation and ROS production[J].Inflamma Rese，2017，66（7）：579-589.

[9] 白淑榮，沈樂，陳乾，等.原發性干燥綜合征相關間質性肺疾病患者血清活性氧、轉錄因子κB及轉化生長因子β1水平變化及其臨床意義研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2017，25（ 11）：42-45.

[10] PERTOVAARA M，SILVENNOINEN O，ISOM?KI P.STAT-5 is activated constitutively in T cells，B cells and monocytes from patients with primary Sj?gren's syndrome[J].Clin Exp Immunol，2015，181（1）：29-38.

[11] AIR? P，GHIDINI C，ZANOTTI C，et al.Upregulation of myxovirus-resistance protein A：a possible marker of type Ⅰ interferon induction in systemic sclerosis[J].J Rheumatol，2008，35（11）：2192-2200.

[12] ZHANG J，SZE DMY，YUNG BYM，et al.Distinct expression of interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats （IFIT） 1/2/3 and other antiviral genes between subsets of dendritic cells induced by dengue virus 2 infection[J].Immunology，2016，148（4）：363-376.