布魯菌基因缺失株ΔVceA的感染特征研究

劉 航，何佳琪，王小鳳，李明奇，郭 嘉，趙天藝，張 樊，吳長新，張 輝

（石河子大學動物科技學院 動物疾病防控兵團重點實驗室，石河子 832003）

布魯菌病是我國二類動物疫病，是一種人獸共患傳染病。家畜感染布魯菌的臨床癥狀一般表現為關節腫大，體溫升高，母畜表現為流產和死胎。目前，布病的發病率在全球范圍內不斷升高[1]，各國都加強了對布魯菌病的重視，以避免布病帶來的經濟損失和對公共衛生的危害[2]。

布魯菌病引起母畜流產是由于胚胎滋養層細胞受到了損害[3]，而布魯菌的經典毒力因子有脂多糖、四型分泌系統[4]、外膜蛋白以及Bvr R/Bvr S雙組分系統等[5]。在布魯菌造成機體慢性感染的過程中，四型分泌系統起著重要的作用，其分泌的效應因子可以引起機體各方面的紊亂，這些效應因子的結構與蛋白質類以及核蛋白復合體的結構相似。在機體被其感染后可誘導產生IL-18等多種炎癥因子并引發炎癥反應[6]。IL-1β和TNF-α等促炎因子在機體抵抗病原過程中發揮重要作用[7]。我們在前期研究中，已篩選出了布魯菌的一個效應分子VceA，并證實了其在弱毒株中的表達量低于強毒株。但是VceA在布魯菌感染機體的過程中功能尚不明確。本研究培養布魯菌S2308的VceA基因缺失株，分析其生長特點并與親本株做比較。布魯菌VceA基因缺失株侵染HTP-8細胞后，對細胞的炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌水平進行檢測；用ΔVceA感染小鼠，采集脾臟組織，進行CFU計數。本研究為進一步探究T4SS分泌蛋白VceA的功能提供理論基礎，對于有效的防控布魯菌病，維護社會公共衛生安全有著重大意義。

1 材料與方法

1.1 菌株布魯菌2308株由石河子大學動物科技學院人獸共患病重點實驗室保存；布魯菌VceA基因缺失株由實驗室構建。

1.2 試驗動物27只SPF級BALB/c小鼠，5-7周齡，雌性，體重（20±2）g，購于新疆醫科大學動物中心。

1.3 試劑布魯菌固體培養基（BrucellaAgar）和液體培養基（BrucellaBroth）均購自BD公司；氨 青霉素以及卡那青霉素購自Pfizer公司；其他均為國產分析純。

1.4 布魯菌的培養將保存在-80℃冰箱的布魯菌S2308和S2308的基因缺失株ΔVceA取出，于超凈生物安全柜中在布魯菌固體培養基上“四區法”畫線，密封，37℃條件下恒溫倒置培養2 d。

1.5 牛種布魯菌ΔVceA生長特性檢測 分別挑取S2308的基因缺失株ΔVceA單克隆菌落置于布魯菌液體培養基中200 r/min、37℃培養至D600為0.1時，每隔120 min收取一次菌液，滅活檢測D600的值，繪制生長曲線圖。

1.6 HPT-8細胞的侵染及細胞因子的檢測

1.6.1 細菌侵染細胞 使用6孔板進行細胞侵染實驗，待細胞貼壁后，更換培養液，按照侵染復數MOI=100∶1將布魯菌加至細胞上清液中，混勻后置于37℃、5% CO2的培養箱中1 h；每孔加入3.5 μL/mL硫酸慶大霉素作用50 min后，棄細胞培養液；PBS清洗3次后添加新的細胞培養液，置于37℃、5% CO2細胞培養箱培養。

1.6.2 侵染HPT-8細胞后細胞因子的檢測 分別用S2308和ΔVceA侵染HPT-8細胞，并于3 h、12 h、24 h收取細胞上清液，并分別用TNF-α和IL-1β的ELISA試劑盒檢測其表達量，繪制標準曲線，結果見圖1。

1.7 侵染HPT-8細胞后CFU計數將生長狀態良好的HPT-8細胞移至新的6孔板中，每孔細胞個數約為106。當細胞貼壁后，加入生長到對數生長期的菌量為108的布魯菌S2308株和ΔVceA，分別在侵染3 h、12 h 和24 h時用曲拉通裂解細胞，梯度稀釋后涂布至布魯菌固體培養基，密封，37℃條件下恒溫倒置培養3 d，進行CFU計數。

圖1 炎性細胞因子標準曲線Fig.1 The standard curve of inflammatory cytokines

1.8 感染小鼠模型的建立將保存在-80℃冰箱的布魯菌S2308和S2308的基因缺失株ΔVceA取出，于生物安全柜中在布魯菌固體培養基上“四區法”畫線，密封，37℃條件下恒溫倒置培養2～3 d，進行CFU計數。每組9只小鼠，每只小鼠腹腔注射200 μL CFU計數為5×106moL/L的布魯菌S2308株和S2308的基因缺失株ΔVceA，對照組的小鼠腹腔注射等量的PBS緩沖液。

1.9 小鼠脾臟的CFU計數分別于兩組小鼠腹腔注射布魯菌后第1 d、7 d、14 d、28 d、56 d時，在無菌環境中取出小鼠脾臟，將脾臟組織剪碎后放入無菌的EP管中，加入800 μL的PBS進行30 min勻漿，用PBS緩沖液進行梯度稀釋，第1 d、7 d、14 d時用103和104的稀釋度涂布布魯菌固體培養基，第28 d、56 d時選用102和103稀釋度涂布，密封，37℃條件下恒溫倒置培養3 d后計算生長的菌落數。

2 結果

2.1 布魯菌S2308株ΔVceA及其親本株S2308生長曲線 通過觀察布魯菌S2308株ΔVceA及S2308的生長曲線，布魯菌S2308株ΔVceA與S2308生長到對數期和平臺期的時間分別是12 h和24 h，見圖2。S2308株ΔVceA及S2308的生長曲線無明顯差異，這表明布魯菌VceA基因的缺失不影響布魯菌的生長。

圖2 布魯菌S2308ΔVceA與其親本株S2308的生長曲線Fig.2 The gowth curve of Brucella S2308 ΔVceA strains and S2308 strain

2.2 VceA 缺失株對HPT-8細胞的細胞因子分泌的影響在布魯菌侵染HPT-8細胞3 h、12 h和24 h時收取上清液，根據檢測TNF-α和IL-1β炎癥因子的試劑盒說明書操作，用酶標儀在D450處測定吸光值，然后依據標準曲線公式來計算TNF-α和IL-1β的濃度，結果見圖3。在布魯菌侵染細胞后3 h、12 h和24 h時，侵染組TNF-α和IL-1β的分泌量均高于對照組，在布魯菌侵染細胞后12 h時親本株組的TNF-α和IL-1β的分泌量均高于缺失株組。

2.3 牛布魯菌ΔVceA侵染HPT-8細胞后及感染小鼠后的CFU計數 布魯菌ΔVceA及其親本株S2308以100∶1侵染復數侵染HPT-8細胞，在侵染后第0 h、3 h、12 h、24 h時用曲拉通裂解細胞，收樣稀釋到102和103后分別涂布至布魯菌固體培養基，密封，37℃倒置培養3～5 d后計算菌落數，繪制折線圖（圖4A）。結果顯示，布魯氏菌ΔVceA在侵染12 h時CFU計數顯著低于親本株，在侵染24 h時和親本株S2308差異不顯著，不具有統計學意義。

兩組小鼠腹腔注射后，于感染后第1 d、7 d、14 d、28 d 和56 d時無菌取出小鼠脾臟，勻漿后加入PBS梯度稀釋，涂布至布魯菌固體培養基，密封，37℃倒置恒溫培養3～5 d后計數，結果見圖4B，ΔVceA在感染后第14 d時顯著低于親本株（P<0.01），之后有上升的趨勢，在第28 d時和親本株差異不顯著，不具有統計學意義。

圖3 細胞因子表達量Fig.3 The expressions of cytokines

3 討論

布魯菌的T4SS是一種多蛋白復合體，研究布魯菌T4SS對研究布魯菌的致病機理有很大幫助[8]。T4SS首次被發現時的效應因子就有VceA，其分泌的效應因子能夠幫助布魯菌在細胞內的生存，對機體持續造成感染[9]。研究表明，T4SS分泌的效應蛋白VceA是由105個氨基酸組成的蛋白質，在已公布的布魯菌基因組中都是保守的，VceA編碼的蛋白質是T4SS的蛋白新底物[10-12]。

圖4 牛布魯菌ΔVceA和S2308在HPT-8細胞中的存活能力和在小鼠脾臟中的載菌量Fig.4 Survival ability of Brucella bovis ΔVceA and S2308 in HPT-8 cells and their carrying capacity in mouse spleen

布魯菌感染機體后，巨噬細胞和單核細胞均能快速識別病原菌的入侵，釋放的促炎因子在感染初期對NLRP3炎癥小體有暫時的抑制作用，并通過這條途徑抑制相關細胞因子IL-1β和IL-18的表達，而胞外其他致炎因子的表達量也會因為IL-1β和IL-18分泌到胞外的刺激而升高。史靜雪等[15]在對VceA研究中發現，VceA蛋白刺激細胞后，細胞的炎性因子IL-1β、IL-18、TGF-β1和TNF-α的表達量均有不同程度的升高。劉來珍等[14]在研究布魯菌T4SS分泌蛋白功能時也證實了其對細胞因子IL-1β的釋放具有一定的作用。本研究中布魯菌侵染組TNF-α和IL-1β的分泌量均高于PBS對照組、親本株組均高于布魯菌的ΔVceA基因缺失株組，在感染的過程中這些細胞因子分泌量的變化可能與布魯菌胞內寄生機制相關。

本研究用布魯菌S2308基因缺失株ΔVceA侵染HTP-8細胞以及構建小鼠感染模型，通過觀察繪制的布魯菌的生長曲線可以看出，布魯菌S2308 ΔVceA缺失株和親本株在生長趨勢上基本一致，證明VceA基因的缺失對布魯菌的生長沒有影響。脾臟作為動物體內的免疫器官，從小鼠感染布魯菌的模型采集的脾臟組織進行CFU計數[16]，缺失株感染初期顯著低于親本株，之后和親本株并無明顯差異，這些變化與布魯菌在體內生存能力有著很大關系，為進一步探索布魯菌四型分泌系統，揭示其致病機理提供依據。