酶菌聯合處理玉米蛋白粉制備高蛋白原料的研究

陳國明 史路路 張家學 齊振雄

(廣東海大集團股份有限公司畜牧水產研究中心海大中央研究院農業農村部微生態資源養殖利用重點實驗室，廣東廣州511400)

玉米蛋白粉是玉米濕法生產淀粉的副產物，蛋白質含量約60%，其余約為20%的淀粉和少量酯類、玉米黃素、葉黃素等[1]，具有蛋白含量高、低纖維素、富含維生素B 和維生素E、不含抗營養因子等諸多優點[2]。玉米蛋白粉是一種非全價蛋白質，目前主要用于飼料處理，在水產畜禽上都有較好的應用效果。Arash等[3]試驗證明配方中添加一定比例的玉米蛋白粉能有效地改善肉仔雞的生長性能，飼料中添加12%的玉米蛋白粉，肉仔雞的體重增長最快。朱磊等[4]研究表明，在黃顙魚擠壓膨化飼料中可以使用6%的玉米蛋白粉，能夠維持黃顙魚的正常生產性能和正常生理功能。程媛媛等[5]研究表明，用5%玉米蛋白粉替代飼料中9.10%魚粉，配制等氮等能的試驗飼料，飼養羅氏沼蝦53 d 后，得出5%玉米蛋白粉組蝦的生長和飼料利用與對照組無顯著差異（P>0.05）。由于玉米蛋白粉中含有一定量的碳水化合物，這限制玉米蛋白粉在高檔水產料飼料中的用量。目前國內外大多數的研究主要集中在提升玉米蛋白粉蛋白溶解度和多肽得率，在提高蛋白含量方面的研究較少。本試驗從提升蛋白質含量的角度出發，通過以酵母菌、糖化酶、淀粉酶協同處理的方式進行固體發酵，并通過單因素試驗、正交試驗優化發酵條件，以期提高玉米蛋白粉蛋白與氨基酸含量，制備出一種高蛋白飼料原料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品及菌株來源

玉米蛋白粉：由海維飼料有限公司贈送；釀酒酵母：自制活菌數為150 億cfu/g 的活性干酵母，菌種來源于海大研究院菌種庫；糖化酶和淀粉酶：購于尤特爾生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與設備

恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；烘箱（上海精宏實驗設備有限公司）；凱氏定氮儀（上海纖檢儀器有限公司）；水浴鍋（常州國立試驗設備研究所）；恒溫搖床（太倉市華利達實驗設備有限公司）；電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；pH計（上海三信儀表廠）；滅菌鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

玉米蛋白粉200 g，料水比為1：0.7，用碳酸鈉調pH 值至6.5，糖化酶與底物比為0.4%，淀粉酶與底物比為0.2%，酵母菌接種量0.3%，接種、攪拌均勻后用PE 袋密封包裝，置于培養箱中發酵，發酵溫度35 ℃，發酵時間24 h。在上述各單因素的基礎上，對需要研究的單因素進行不同水平的調整，分別為：糖化酶與底物比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、淀粉酶與底物比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、酵母菌接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、料水比例（1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8）、發酵溫度（25、30、35、40、45 ℃）、發酵時間（8、16、24、32、40、48 h）、初始pH 值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5），每組進行3 個平行試驗。樣品在60 ℃下烘干4 h，粉碎。測定含水量及蛋白質含量，根據蛋白質含量來確定單因素試驗的最佳條件。

1.2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，確定影響較為顯著的因素進行正交試驗，以發酵后蛋白質含量為指標確定最佳發酵條件。

1.2.3 測定指標及方法

①水分：GB/T 6435—2006飼料中水分和其他揮發性物質含量的測定。

②蛋白含量：凱氏定氮法，按照GB/T 5009.5—2010方法進行測定，結果為風干基礎，水分12%(與玉米蛋白粉原料水分保持一致)。

③氨基酸：酸解法，參照GB/T 18246—2000進行測定。

1.2.4 數據處理

結果以“平均值±標準差”表示，數據處理與分析采用Microsoft Excel與SPSS 23.0軟件進行。

2 結果

2.1 單因素試驗

2.1.1 糖化酶底物比對發酵效果的影響(見圖1)

圖1 糖化酶底物比對發酵效果的影響

糖化酶能在淀粉鏈的非還原性末端切開α-1-4鍵處，也能緩慢切開a-1-6鍵，把直鏈淀粉、支鏈淀粉水解成葡萄糖，供酵母菌生長利用，進而提高蛋白含量。其添加量過少達不到最佳效果，添加過多又會造成資源的浪費。由圖1 結果可見，糖化酶底物比為0.1%～0.4%時，發酵后蛋白含量隨著糖化酶底物比的加大而增高，繼續增大加酶量，發酵后蛋白不再增加。綜上可見，選擇0.4%的糖化酶底物比最為合適，此時發酵后的蛋白達到73.05%。

圖2 淀粉酶底物比對發酵效果的影響

2.1.2 淀粉酶底物比對發酵效果的影響(見圖2)淀粉酶能把玉米蛋白粉中的淀粉水解成糊精和糖，與糖化酶搭配使用，強化效果。淀粉酶不同底物比所對應的蛋白變化規律與糖化酶的效果類似，確定最適的淀粉酶底物比為0.2%。

圖3 酵母菌接種量對發酵效果的影響

2.1.3 酵母菌接種量對發酵效果的影響(見圖3)酵母菌在發酵過程中可以利用淀粉轉化而成的糖類，還可以轉化成豐富的菌體蛋白，最終達到濃縮蛋白的目的。由圖3 可見，酵母菌接種量在0.1%～0.3%時，隨著酵母菌接種量的增加，發酵后蛋白含量也隨之增加，當接種量達到0.4%以后，蛋白含量不再增加，因此最合適的接種量為0.3%。

圖4 料水比對發酵效果的影響

2.1.4 料水比對發酵效果的影響(見圖4)固態發酵基質中少量的水分能夠溶解菌體生長繁殖所需要的一些營養物質及代謝產物，有利于促進微生物生長，水分過少易導致物料干結而使微生物生長緩慢，而過高又會使發酵基質黏著成團，并且容易使物料感染雜菌、發霉變質。由圖4 的結果可見，發酵時的水分越高，發酵后蛋白含量也越高，但差距不大，考慮到發酵后烘干的成本，因此選擇1：0.7 的料水比較適合。

2.1.5 發酵時間對發酵效果的影響(見圖5)

圖5 發酵時間對發酵效果的影響

發酵時間過短，菌的代謝及對糖分的利用還不充分，發酵時間過長又造成資源的浪費，且容易滋生雜菌。由圖5可見，發酵24 h內樣品的蛋白隨著發酵時間的延長而不斷增加，24 h 后蛋白含量趨于穩定，發酵24 h時蛋白含量即可達到73%以上，因此發酵24 h較為合適。

2.1.6 溫度對發酵效果的影響(見圖6)

溫度是微生物和酶制劑發揮作用的關鍵因素之一。溫度過高和過低都會影響到最終處理效果。由圖6可知，最適的處理溫度為35 ℃。在35 ℃處理時，蛋白含量可以提升至72%以上。

2.1.7 pH值對發酵效果的影響(見圖7)

圖6 溫度對發酵效果的影響

圖7 pH值對發酵效果的影響

pH 值同樣影響著菌的生長與酶的作用。通過不同pH 值發酵試驗，得出合適的發酵pH 值范圍是6.0～7.0，最適發酵pH 值是6.5，發酵后蛋白含量達到73%，當pH 值偏酸或偏堿時，發酵后蛋白含量相對較低。

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選定了糖化酶底物比、淀粉酶底物比、發酵溫度、發酵時間4 個因素，采用L9（34）正交試驗進行最佳發酵條件的研究，以發酵后的蛋白含量為考察指標。

由表2 正交試驗分析，比較各因素對蛋白含量的極差大小及平均值，可知不同參數對蛋白含量影響由大到小為RA>RC>RB>RD，其中糖化酶的底物比對發酵的影響最顯著，得出發酵的最優因素組合為A3B2C2D2，即最適合添加量組合是糖化酶0.4%、淀粉酶0.2%、發酵溫度35 ℃、發酵時間24 h。在此條件下對最優條件進行試驗驗證，得到蛋白含量為73.08%。

2.3 發酵前后氨基酸的變化(見表3)

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗結果

糖化酶、淀粉酶與酵母菌聯合發酵后氨基酸含量的變化較大，發酵后總氨基酸含量由62.61%提高至76.61%，提高了22.36%，不同的氨基酸都有一定程度的含量提升，尤其是必需氨基酸，除色氨酸和賴氨酸外，其他6種氨基酸提升率都達到20%以上。

3 討論

玉米蛋白粉中含有15%～21%的淀粉，通過復合酶與微生物的聯合作用，進行一系列的降解與轉化，最終達到蛋白濃縮的目的。本研究以密封厭氧發酵的方式進行發酵，不需要另外控制發酵環境的濕度，避免發酵過程水分的損失而影響酶解效果，另外酵母菌屬于兼性厭氧菌，也可以在厭氧環境下生長。通過添加糖化酶與淀粉酶可以將玉米蛋白粉中的淀粉水解，水解得到的糖類再被酵母菌代謝利用，進而可以濃縮提高蛋白含量，優化發酵條件后得到蛋白含量73%以上、氨基酸含量76%以上的高蛋白飼料原料。盡管通過酶解或微生物發酵可以全面提升玉米蛋白粉的水解度、蛋白、氨基酸等指標，但是發酵后的賴氨酸和色氨酸仍然較低，使發酵玉米蛋白粉作為高蛋白飼料原料受到一定的限制。目前的研究主要是通過添加游離氨基酸或與其他蛋白源來混合使用，饒春鳳等研究玉米蛋白粉替代魚粉對凡納濱對蝦生長的影響，得出飼料中補充賴氨酸和蛋氨酸，可提高玉米蛋白粉在凡納濱對蝦飼料中的替代比例，其替代魚粉蛋白比例可以提高到15%，占飼料比例的4.5%[6]。在必需氨基酸方面，玉米蛋白粉所含氨基酸總量大于大豆粉和魚粉，其中總含硫氨基酸和亮氨酸含量高于大豆粉和魚粉，但賴氨酸及色氨酸含量較低，可與大豆粉和魚粉的蛋白源相互補充[7]。盡管對于水產動物能否能真正利用游離氨基酸還存在爭議，但是在玉米蛋白粉飼料中添加游離氨基酸起到了比較積極的效果[8]。因此，怎樣改善氨基酸營養價值，怎樣與其他蛋白源科學搭配互補，仍然是發酵玉米蛋白粉值得探討之處。

表3 發酵前后氨基酸含量的變化（風干基礎，%）

4 結論

本試驗以提升蛋白，制備高檔水產飼料的高蛋白原料為出發點，以糖化酶、淀粉酶與酵母菌聯合進行玉米蛋白粉密封厭氧固體發酵，通過單因素試驗與正交試驗，得出最佳發酵條件為：糖化酶底物比0.4%、淀粉酶底物比0.2%、酵母菌接種量0.3%，料水比1：0.7、溫度35 ℃、起始pH 值6.5、密封發酵時間24 h，發酵及酶解處理后樣品的蛋白提升至73.08%，提高21.80%，總氨基酸與總必需氨基酸分別提高22.36%、23.60%。