代謝綜合征患者腸道菌群特征探析▲

王 萍 王 穎 萬 紅 段 飛 燕樹勛

(1 河南中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科二病區，鄭州市 450000；2 鄭州大學第一附屬醫院老年心血管科，河南省鄭州市 450000，電子郵箱：wangping2016a@163.com)

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是全球公認的健康“隱形殺手”[1]。MS包括糖脂代謝紊亂、高血壓、高尿酸血癥等，其發病機制尚未明確。既往認為，胰島素抵抗是MS發病的核心機制，而肥胖、炎癥反應、環境因子、遺傳因子是胰島素抵抗的影響因素[2]。但也有學者認為，盡管血糖升高與胰島素抵抗密切相關，但肥胖或能量失衡與MS危險因素的關聯性更緊密[3]。臨床發現，在相同的遺傳背景和能量攝入條件下，人體高血糖和體重增加等的表現差異較大[4-5]。多項研究表明，腸道菌群與代謝性疾病關系密切，MS進程中的糖脂代謝紊亂、氧化應激炎性反應等均可引起腸道菌群改變，腸道菌群的紊亂又可加速MS的進展[6-7]。腸道菌群能夠影響宿主的糖、脂肪、蛋白質等多種營養物質的代謝，并維持腸黏膜功能正常[8]，是宿主的一個“能量代謝器官”[9-10]。目前對MS的治療側重于單一的減重、降糖、調脂、降壓等，缺乏特異性多靶點治療藥物，而通過不同方式調節腸道菌群，改善代謝紊亂，是一種潛在的治療方法。然而，目前關于腸道菌群與MS關系的研究仍以動物實驗為主，本研究觀察MS患者的腸道菌群特點，分析腸道微生物與MS的內在聯系，以期為臨床治療MS提供新的治療靶點和個性化的防治策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年3～5月于河南中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科住院治療的26例MS患者為觀察組，其中男性14例，女性12例，年齡36～63(41.60±6.85)歲。另選取32例在社會招募及在河南中醫藥大學第一附屬醫院參與健康體檢的健康志愿者為對照組，其中男性18例，女性14例，年齡35～60(42.67±6.36)歲。MS組納入標準：(1)符合中華醫學會糖尿病學分會制定的MS診斷標準[11]；(2)漢族，年齡35～65歲。對照組納入標準：(1)身體狀況良好的非MS人群；(2)漢族，年齡35～65歲，無不良生活習慣(如抽煙、喝酒、長期飲用碳酸飲料)；(3)常規體檢項目均在正常值范圍。兩組排除標準：(1)近1周內有感染、發熱、創傷、燒傷的患者或活動性肺結核病或風濕免疫疾病者；(2)有較嚴重的腸道疾病或代謝性疾病史，近4周內有腹瀉、便秘等胃腸道反應；(3)合并甲狀腺功能異常等其他內分泌疾病、冠心病、心臟瓣膜病(1個及以上瓣膜發生中度病變)或原發性心肌病、嚴重肺部疾病及腦血管疾病、腎功能不全(血清肌酐男性>221 μmol/L，女性>177 μmol/L)、肝功能不全[谷丙轉氨酶>正常值(40 U/L)的3倍]或合并肝硬化、造血系統或惡性腫瘤等嚴重原發性疾病、臟器移植、既往有手術史者；(4)近3個月內使用過可能影響腸道菌群變化的藥物，如抗生素、非甾體類藥物、微生態制劑、胃腸動力藥物等；(5)嚴重精神障礙患者(如感知障礙、思維障礙等)；(6)孕婦、哺乳期婦女；(7)正參加其他臨床試驗的志愿者；(8)標本留取過程中有污染者、未及時凍存者、標本留取量不足者。兩組研究對象之間無血緣關系，年齡、性別差異均無統計學意義(均P>0.05)。所有研究對象均自愿參與本研究并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集和檢測方法 樣本采集前，采用調查問卷詳細記錄受試者的年齡、性別、飲食習慣及飲食結構(三餐飲食習慣、飲食量及食物結構配比)等特征。糞便樣本采集前排凈小便。用無菌一次性采樣杯采集新鮮糞便樣本后保存于常溫保存液中(含樣品保護液)，7 d內完成DNA提取。

由博奧頤和健康科學技術(北京)有限公司采用PCR技術擴增和Illumina MiSeq高通量測序平臺分析兩組研究對象腸道菌群的結構和屬水平上的相對豐度。糞便樣本采用16S rRNA細菌檢測技術鑒定腸道菌群。16S rRNA細菌檢測方法為：采用糞便提取試劑盒(天根生化科技有限公司，批號：DP711-T1)對糞便樣本進行基因組DNA抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA純度和濃度。隨后采用KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit(美國KAPA Biosystems，批號：KK2602)擴增細菌16S rRNA的V3～V4區，上下游引物序列分別為5′-X-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；PCR反應體系包含0.25 μL高保真聚合酶，5 μL 5×反應緩沖液，5 μL 5×高GC緩沖液，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，10 μL模板DNA，1 μL正向引物(10 μmol/L)，1 μL反向引物(10 μmol/L)，11.25 μL超純水；PCR擴增程序為98℃預變性5 min，98℃變性0.5 min、50℃退火0.5 min、0.5 min延伸72 ℃共25個循環，72℃擴展延伸5 min。將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司，批號：AP-GX-50)切膠回收PCR產物，采用Tris-Hcl洗脫回收產物；將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量，按照對DNA量的測序要求將各樣本按比例混合后構建Illumina平臺文庫并測序。

1.3 質量控制 前期培訓所有調查人員，使其掌握相關檢測標準。隨機重復檢測10%的糞便樣本。糞便腸道菌群由博奧頤和健康科學技術(北京)有限公司統一檢測。由不同人員采用Excel軟件采取雙人雙錄入模式錄入數據。

1.4 生物信息學分析 采用Trimmomatic軟件(v0.27)[博奧顧和健康科學技術(北京)有限公司]以滑動窗口法對雙端的核酸序列進行質量過濾。利用Vsearch軟件(v2.8.1)依照97%相似性劃分分類操作單元，聚類時剔除嵌合體；基于分類操作單元的聚類分析結果和分類學信息對各個分類水平進行群落結構的統計分析。通過Mothur 1.31.2軟件獲得Alpha多樣性指數中的Ace指數和Shannon指數；Ace指數反映標本中菌群豐度，即分類操作單元數量；Shannon指數反映菌群的多樣性，包括菌群豐度和菌群均勻度。采用Qiime軟件(v2.1)計算標本間un-weighted unifrac距離矩陣以分析菌群的β多樣性，并繪制主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)圖形。

1.5 統計學分析 應用Excel 2013及SPSS 23.0軟件進行數據的錄入與分析。符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，比較采用兩獨立樣本t檢驗或t′檢驗；非正態分布的計量資料以M(P25，P75)表示，比較采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組樣品主坐標分析結果 PCoA結果可顯示菌群在不同環境下的相似性和差異性。圖1中每個點都代表1個檢測樣本的菌群，點與點間距離大小代表菌群之間的相似性，距離越小越相似；觀察組和對照組在PCoA圖上均能各自聚類，說明兩類人群的腸道菌群β多樣性具有差異。見圖1。

圖1 兩組樣品PCoA圖

2.2 兩組樣品多樣性分析 觀察組Ace指數為82.76±7.47，Shannon指數為4.22±0.82；對照組Ace指數為157.54±10.76，Shannon指數為7.73±1.92；觀察組Ace指數、Shannon指數均低于對照組(t=30.022，P<0.001；t′=9.346，P<0.001)。

2.3 兩組樣品微生物屬水平上的相對豐度 觀察組的芽孢桿菌屬、梭菌屬、普雷沃氏菌屬、巨單胞菌屬、腸球菌屬的豐度高于對照組，瘤胃球菌屬、毛螺菌屬的豐度低于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組樣品微生物屬水平上的相對豐度[M(P25，P75)]

3 討 論

厚壁菌門中的大多數細菌可產生丁酸鹽，研究表明，肥胖小鼠腸道丁酸鹽含量明顯高于非肥胖小鼠，且產生丁酸鹽的細菌含量增加可加強宿主的攝食能力，導致肥胖的發生[12-13]，而腹型肥胖為MS發生的核心機制之一[3]。芽孢桿菌在健康成人胃腸道中存在的比例較少，而相對于普通人群，肥胖人群腸道中芽孢桿菌含量明顯升高[14]。波士頓醫學中心的研究人員證實梭菌感染是肥胖發生的可能風險因子[15]。Zhang等[16]的研究證實肥胖者腸道中的普雷沃氏菌含量豐富。普雷沃氏菌可參與碳水化合物和蛋白質的發酵，促進機體更有效地從食物中攝取營養成分[17]。巨單胞菌可發酵各種碳水化合物產生乙酸、丙酸和乳酸，乙酸能進入肝臟代謝，參與肌肉、脾臟、心臟和腦內代謝[18]。腸球菌為人和動物腸道內的正常菌群，但在一定條件下也是條件致病菌。韓豎霞等[19]的研究表明腸球菌屬是老年糖尿病患者尿路感染的病原菌。腸道中腸球菌屬含量與三酰甘油水平呈正相關，腸球菌屬占腸道總細菌的比例與高密度脂蛋白水平呈負相關[20]。有學者發現，飼養寵物的青少年腸道內可能擁有較多的瘤胃球菌，這可能與其過敏和肥胖癥發生率低相關[21]。高脂飲食能夠增加回腸和結腸內炎癥因子的表達，而腸道中毛螺菌/鏈球菌比例失調亦可引起代謝紊亂，與腸道炎癥密切相關[22]。本研究結果顯示，兩組樣品菌群組成差異較大，觀察組的菌群多樣性指數、瘤胃球菌屬及毛螺菌屬豐度低于對照組，芽孢桿菌屬、梭菌屬、普雷沃氏菌屬、巨單胞菌屬、腸球菌屬豐度高于對照組(P<0.05)，提示MS患者與健康人群腸道菌群的多樣性及上述菌群豐度存在差異。

有研究表明，MS肥胖男性患者在接受來自體重正常人群的糞菌移植后，其三酰甘油水平迅速下降，證實了腸道菌群和脂代謝關系密切，且糞菌移植對能量代謝相關疾病可能有一定的療效[23]。在限制脂肪和碳水化合物飲食后，肥胖患者體質量明顯下降，胰島素抵抗得到改善，腸道菌群結構發生改變[24]。而益生菌及益生元可通過改善腸道菌群紊亂來降低炎癥因子水平、提高胰島素敏感性，改善MS病情[25]，如加氏乳桿菌能降低肝臟三酰甘油水平及脂肪基因的表達，從而在一定程度上防止體重的增加[26]。此外，Zhong等[27]發現丹皮、赤芍可調節高脂飲食導致的腸道菌群失調，其作用類似于二甲雙胍。以上研究均提示，由糖脂代謝紊亂、炎癥反應等引起的MS與腸道菌群的紊亂關系密切。

綜上所述，MS患者與健康人群腸道菌群的多樣性及特定菌群豐度存在差異，差異菌群集中在厚壁菌門(包括芽孢桿菌屬、梭菌屬)、普雷沃氏菌屬、巨單胞菌屬、腸球菌屬、瘤胃球菌屬、毛螺菌屬等，MS患者腸道菌群失調可能與MS的發生和發展有關。