基于生物信息學鑒定黏液樣脂肪肉瘤中甲基化調控的差異表達基因▲

李倩茹 張?？?孟 蓮 劉春霞

(1 石河子大學醫學院病理學系，新疆地方病與民族疾病重點實驗室，石河子市 832002，電子郵箱：1509094295@qq.com；2 石河子大學醫學院第一附屬醫院病理科，新疆石河子市832002)

脂肪肉瘤包括去分化脂肪肉瘤、黏液樣脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma，MLPS)及多形性脂肪肉瘤等多種組織學亞型，而MLPS約占脂肪肉瘤的30%[1-2]。雖然治療后MLPS患者的生存率得到很大提高，但目前的化療方案對復發或轉移性患者的治療效果仍不佳[3-4]。目前MLPS發生的確切機制尚不清楚[4]。因此，探索MLPS遺傳和表觀遺傳變化相關的特定生物標志物和治療靶點，可為患者的預后判斷提供依據。大量研究表明，甲基化是表觀遺傳的關鍵修飾因子之一，其不僅是腫瘤發生的重要表觀遺傳學機制，還可為尋找人類疾病相關生物標志物和治療靶點提供方向[5-7]。在CpG島中，異常甲基化可影響癌基因和抑癌基因的功能，然而目前關于DNA甲基化對單個基因影響的研究仍然不充分。因此，本研究基于數據庫鑒定MLPS中甲基化調節的差異表達基因(methylation-regulated differentially expressed genes，MeDEGs)，利用一系列分析工具篩選出異常甲基化基因，為MLPS的發生、診斷及預后判斷提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 本研究從GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中篩選出基因系列集GSE59568[8]和DNA甲基化系列集GSE52391[3]。GSE59568包含6個MLPS組織樣本(MLPS組)和3個正常脂肪組織樣本(對照組)；GSE52391包含10個MLPS組織樣本(MLPS組)和2個正常脂肪組織樣本(對照組)。對上述2個數據集中的樣本進行后續分析。

1.2 鑒定MeDEGs 采用GEO 自帶的GEO2R分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)，對GSE59568和GSE52391系列集進行分析，以P<0.05、|log(FC)| >1和P<0.05、|t| >2為標準，分別篩選差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)和差異甲基化基因(differentially methylated genes，DMGs)。隨后使用Venny 2.1.0在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)分別重疊上調(下調)的DEGs和甲基化過低(高)的DMGs，得到上調(下調)的低(高)甲基化的MeDEGs。

1.3 MeDEGs的富集分析 采用DAVID軟件(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對MeDEGs分別進行基因本體(Gene Ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P<0.05為有效。

1.4 蛋白質相互作用網絡構建和功能模塊分析 通過STRING在線分析工具(https://string-db.org/)得到MeDEGs的蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡，中信度分數> 0.4時被認為重要。以TSV格式輸出，并導入Cytoscape軟件(http://www.cytoscape.org/download.php；版本3.5.1)。在Cytoscape軟件引入插件cytoHubba篩選PPI網絡的Hub基因，同時使用插件MCODE構建 PPI 網絡的功能模塊。

1.5 Hub基因的甲基化表達水平和基因表達水平與生存分析 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是基于TCGA數據庫中的相關癌癥數據進行的分析網站，使用此工具分析肉瘤與正常組織樣本之間的DNA甲基化和基因表達水平差異，最終生成用于關系可視化的箱線圖。使用Kaplan-Meier法評估MeDEGs中Hub基因與肉瘤患者總生存率的關系，進而了解異常甲基化基因與MLPS患者的預后關系。

2 結 果

2.1 MLPS的MeDEGs 從GSE59568數據集的MLPS組織和正常脂肪組織中鑒定出1 007個上調和1 298個下調的DEGs(見圖1A)。從GSE52391數據集的MLPS組織和正常脂肪組織中篩選出597個甲基化過高的DMGs和3 577個甲基化過低的DMGs。(見圖1B)。為了獲得DEGs與DMSs呈負相關異常甲基化調控的差異基因；重疊了597個高甲基化DMGs和1 298個下調的DEGs，獲得78個下調的MeDEGs(圖2A)；重疊了3 577個低甲基化DMGs與1 007個上調的DEGs，獲得143個上調的MeDEGs(圖2B)。

圖1 DEGs的火山圖和DMGs的熱圖

圖2 獲得的MeDEGs

2.2 MeDEGs的GO功能和KEGG通路富集分析 使用DAVID對全部MeDEGs進行GO功能和KEGG富集分析。結果顯示，MLPS的MeDEGs主要參與細胞增殖的正負調控、凋亡、核糖體結構成分和蛋白結合等生物學過程，見表1；MLPS的MeDEGs富集在核糖體、癌癥、RAS相關蛋白1(RAS-associated protein，Rap1)、AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和Ras 等信號通路，見表2。

表1 MLPS中MeDEGs的GO富集分析結果

表2 MLPS中MeDEGs的KEGG通路富集分析結果

2.3 PPI網絡和Hub基因 通過STRING和Cytoscape繪制MeDEGs的PPI網絡并進行圖像可視化，使用MCODE插件篩選PPI功能模塊，其中頂級模塊主要富集在核糖體，見圖3。使用插件cytoHubba篩選出前20個Hub基因，包含核糖體蛋白質家族成員核糖體蛋白(ribosomal protein，RP)L9、RPL31、RPL36、RPS2、RPS21、RPL39L、RPL15、RPS23、NHP2、細胞質多聚(A)結合蛋白1[poly(A)binding protein，cytoplasmic 1,PABPC1]、細胞分裂周期相關蛋白(cell division cycle-associated protein,CDCA)5、非SMC凝縮素Ⅰ復合亞基G(non-SMC condensin Ⅰ complex,subunit G,NCAPG)、甲狀腺激素受體相互作用物13(thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13)、無齒的E3泛素蛋白連接酶同源(denticleless E3 ubiquitin protein ligase homolog,DTL)、無缺口同源物1(notchless homolog 1,NLE1)、Geminin DNA復制抑制劑(Geminin,DNA replication inhibitor,GMNN)、胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase,TYMS)、CDC7、小核糖核蛋白D2多肽(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide D2,SNRPD2)和BYSL基因，這20個Hub基因皆為上調的MeDEGs，見表3。

圖3 MeDEGs的PPI網絡和頂級模塊

表3 MeDEGs中前20個Hub基因

2.4 Hub基因在肉瘤中的甲基化和基因表達水平及其與預后的關系 根據UALCAN工具的分析結果，在肉瘤組織中發現RPL36、RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS、SNRPD2和BYSL的甲基化和基因表達與MLPS中的表達相同，見圖4A。泛癌分析結果還顯示這些基因在大部分腫瘤中顯著上調，見圖4B。采用Kaplan-Meier法評估這些上調基因與肉瘤患者的預后關系，結果顯示RPS2(P=0.008)、CDCA5(P=0.017)、NCAPG(P=0.013)、NLE1(P=0.001)、TYMS(P=0.002)和BYSL(P<0.001)的mRNA表達升高與肉瘤患者不良預后相關(見圖5)。由此推斷，RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS和BYSL基因可能是MLPS患者預后的潛在獨立預測因子。

圖4 各基因在不同腫瘤中的甲基化及基因表達水平

圖5 RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS和BYSL基因表達水平與肉瘤患者預后的關系

3 討 論

分子病理流行病學是使用腫瘤標志物替代疾病病理學的一種新興學科，它將分子病理學和數據科學相結合以幫助精準醫學的開展。目前，利用分子病理流行病學可深入探索腫瘤的病因、發展、預后和結局[9-11]。在分子病理流行病學中，異常甲基化基因作為腫瘤有關的生物標志物和潛在的治療靶點，已受到廣泛關注[12-13]。以往的研究主要集中在MLPS單個基因與甲基化之間的相關性，缺乏對DNA甲基化的系統分析。因此，迫切需要在MLPS患者中鑒定和分析MeDEGs，為后續探索腫瘤的預后標記物以及治療靶點提供可行的參考。

本研究結果顯示，RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS和BYSL基因是MLPS中上調的MeDEGs，且這些基因的過表達與肉瘤患者預后差有關(均P<0.05)。RPS2是一種核糖體蛋白，其高表達與細胞增殖有關，并且可促進前列腺癌、結直腸癌以及星形細胞瘤的形成[14-16]，可作為結直腸癌[15]和前列腺癌[14]的潛在治療靶點。CDCA5在控制細胞周期進程中起重要作用[17-18]，其表達過高與肺癌[19]、口腔鱗狀細胞癌[18]、肝癌[20]等多種癌癥患者預后差有關。NCAPG參與細胞分裂期間染色體的濃縮和穩定化，其與肝癌的多發有關，而低表達可抑制體內肝癌的腫瘤生長，該基因可能為未來治療肝癌提供了新型生物標志物和治療靶點[21-22]。NLE1編碼一種新的含WD40重復序列的蛋白質，可調節Notch信號傳導活性，但其作用機制仍未明確[23]。TYMS是一種基礎的代謝酶，抑制TYMS已被證明是一種有效的人類癌癥治療方法。已有研究報告，TYMS在結腸癌對5-氟尿嘧啶耐藥性以及晚期乳腺癌患者對培美曲塞的耐藥性中起關鍵作用[24-25]。除了與耐藥性有關外，TYMS高表達還與腫瘤的不良預后相關[26-27]。BYSL存在于人類滋養細胞中，雖然BYSL在腫瘤發生中的具體生物學作用仍有待確定，但有學者發現其在肝細胞癌中上調，并且是癌細胞增殖中細胞核生成所必需的[28]。還有學者基于BYSL的黏附和侵入功能發現，其在神經性癌中發揮作用，且是神經性癌的一種重要治療靶標[29]。雖然RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS和BYSL基因對MLPS的作用尚不明確，但綜合以上研究和本研究結果推測，基因的異常甲基化有可能是MLPS發生的關鍵因素之一。

本研究進一步進行了功能富集分析，以闡明甲基化在MLPS中的作用。GO分析顯示，MeDEGs主要富集在細胞增殖的正負調節和凋亡等生物學過程。與正常細胞相比，異常細胞增殖或凋亡被認為是癌細胞的顯著特征，這意味著多個癌基因或抑癌基因呈高或低甲基化。此外，Wnt信號通路的負調節被富集。研究顯示，Wnt信號通路的突變經常發生在人類癌癥中，且其扮演不同的角色[30-31]。GO功能和KEGG通路分析結果均涉及核糖體，表明富集在核糖體的多個基因受異常甲基化的高度調控。近來已有研究證實核糖體是結腸癌發展的重要機制[32]。除了核糖體外，KEGG也富集在癌癥、Rap1信號、AMPK信號和Ras信號等通路。Rap1被認為是一種可以逆轉Ras轉化的蛋白質，是控制整合素激活的關鍵介質[33]。最近有研究表明，Rap1通過調節轉化生長因子β1的Ras同源家族A活性來調節肝星狀細胞遷移[34]。Ras蛋白是多種癌癥的重要調節因子，主要調控活性鳥苷三磷酸和無活性鳥苷二磷酸兩者之間的轉換[35]。AMPK主要在能量平衡和能量代謝中起作用，是代謝疾病的潛在治療靶標[36]。上述研究結果表明核糖體、Rap1信號通路、AMPK信號通路和Ras信號通路都可能是闡明MLPS機制的重要研究靶點。

綜上所述，RPS2、CDCA5、NCAPG、NLE1、TYMS和BYSL等基因的異常甲基化可能與MLPS的發病及預后密切相關，這或可為進一步研究MLPS的發生和發展、篩選預后標記物以及治療靶點等提供新的方向。