基于激光拉曼光譜技術鑒別四種急性白血病細胞系的方法研究

梁昊岳，程雪蓮，楊晚竹，溫 偉，董樹旭，趙軾軒，茹永新

中國醫學科學院血液病醫院(中國醫學科學院血液學研究所)，實驗血液學國家重點實驗室，國家血液系統疾病臨床醫學研究中心，天津 300020

引 言

急性白血病是指原始的造血細胞，尤其是白細胞以克隆、不受控制和自主的方式遭受惡性轉化，并伴隨它們的功能、形態和成熟順序上的改變而引起的一種惡性腫瘤。 常按形態分為髓細胞和淋巴細胞白血病兩大類。 白血病的診斷基于一系列測試，從血細胞計數篩查開始，能夠評估血細胞，然后進行更具侵入性的脊髓造影檢查，分析相關的血管內細胞[1-2]。 這些形態學化驗不足以進行準確的診斷，因此，臨床醫生要求進行更復雜的實驗室檢查，例如流式細胞術和細胞遺傳學檢查，以便進行確鑿的診斷[3-4]。 然而，這些檢查方法對細胞樣本具有侵入性且耗時較長，因此，探索一種新型白血病細胞鑒別方法具有重要的科研和臨床意義。

拉曼光譜是一種新型光學技術，能夠識別與病理狀況相關的生物組織和液體的生化變化，診斷血清中的阿爾茨海默癥以及體外定量人體血液和血清成分等。 拉曼效應是基于可極化分子對入射激光的非彈性散射，有著提供不同材料的振動能級的詳細信息的強大能力。 Vanna等通過拉曼光譜技術鑒定正常和白血病細胞[5]，Ehlicke等鑒別了間充質干細胞和軟骨細胞的不同光譜特征[6]。 Hobro等應用拉曼光譜來提供有關不同淋巴細胞的細胞系組成的生化信息。 雖然拉曼光譜法測量的淋巴細胞系之間的生化差異很小，但結合偏最小二乘判別分析，不僅可以區分T細胞和B細胞，而且可以區分單個T細胞和B細胞系[7-8]。

當被應用于血液及腫瘤疾病的診斷時，拉曼光譜技術具有諸如體內使用的可能性、快速性，不需要試劑或染料來揭示組織生化信息，以及使用少量樣品非破壞性地獲得診斷等優勢[9]。 本實驗使用拉曼光譜技術對人急性T細胞白血病細胞系(Jurkat)、人急性骨髓性白血病細胞系(KG-1α)、人急性早幼粒細胞白血病細胞系(NB4)和人急性單核細胞白血病細胞系(THP-1)展開研討，獲取拉曼光譜數據，通過光譜分析軟件建立區分四種細胞系的方法。 同時，探討拉曼光譜特征，以期為四種急性白血病細胞的早期鑒別診斷提供一種新方式。

1 實驗部分

1.1 四種急性白血病細胞系的培養和傳代

細胞系Jurkat、NB4用RPMI 1640 培養液(含10%胎牛血清)，在37 ℃飽和濕孵箱中培養。 細胞系KG-1α用Iscove’s Modified Dulbecco’s培養液(含20%胎牛血清)，在37 ℃孵箱中培養。 細胞系THP-1用含10%胎牛血清和終濃度0.05 mmol·L-12-mercaptoethanol的RPMI 1640培養液，在37 ℃飽和濕孵箱中培養。

1.2 拉曼光譜檢測

將培養的細胞系細胞借助甩片機Cytospin4涂于石英玻片上，做成待測樣本。 實驗選用共聚焦拉曼光譜儀XploRA Raman microscope對目的細胞展開檢測。 選取785 nm激光作為激發光，輸出功率為40 mW，物鏡選取40倍，拉曼光譜記錄波數范圍為600～1 800 cm-1，標本固定在XYZ三維平臺上，在鏡下隨機選取一個白血病細胞系細胞進行拍攝，拍攝過程使用×40 0.75 NA尼康鏡頭，樣品上約2×2 μm的光斑大小范圍接收輸出功率為40 mW的激光束照射，每種急性白血病細胞系捕獲25～30個細胞光譜數據，每個細胞掃描累積時間為250 s，分辨率為1 cm-1。 應用Labspec6軟件進行平滑、去背景和基線校正等數據處理，全部光譜以各自的1 450 cm-1拉曼峰為內標完成了強度歸一化。

1.3 拉曼光譜數據分析及診斷模型建立

采用SIMCA-P應用軟件對四種白血病細胞系細胞進行主成分分析、偏最小二乘判別分析和聚類分析，建立四種急性白血病細胞鑒別模型。 所有數據操作使用Origin軟件進行。

2 結果與討論

2.1 四種急性白血病細胞平均拉曼光譜的外形比較

本研究共獲得急性白血病細胞系細胞拉曼特征光譜113例，其中jurkat細胞29例，THP-1細胞29例，kG-1α細胞30例，NB4細胞25例(圖1)。 細胞光譜的拉曼峰位歸屬見表1。 在600～1 800 cm-1的范圍內可見四種白血病細胞拉曼光譜，形態相似，可以充分地反映出不同種白血病細胞內物質的含量、組分。

圖1 四組細胞平均拉曼光譜Fig.1 The mean spectrum of the four groups with Raman peaks

表1 細胞拉曼光譜的峰位歸屬Table 1 Molecular structure and composition of Raman peaks

續表1

2.2 四種急性白血病細胞的主成分分析、偏最小二乘判別分析及聚類分析比較

從4類細胞拉曼光譜結果中隨機抽取40張特征光譜(每類10張)，構成四組數據資料。 對樣本數據分析應用有監督主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)展開詳細分析比照。 圖2表明運用有監督的PCA和PLS-DA方法可以很好地甄別jurkat，THP-1，kG-1α和NB4細胞的光譜數據。 PLS-DA模型質量參數R2X=0.434，R2Y=0.863，Q2=0.693，模型質量參數表示該模型歸納了第一、第二兩種主成分整體信息的43.4%，概括了因變量86.3%的變異信息，預估精確度為69.3%。 PCA模型質量參數R2X=0.589，Q2=0.274。 PLS-DA比PCA更好地捕捉了光譜中的差異信息，樣本之間的區分度更好，分群效果更加顯著。 圖3所示四種細胞使用PCA和PLS-DA得到的得分、載荷和聚類結果比較情況，可知PLS-DA對四種白血病細胞系具有更好的鑒別效果。 四種細胞主要通過769，826，844，957，1 048，1 141，1 255，1 313，1 415，1 539和1 575 cm-1等峰位進行區分[圖3(d)]。

圖2 四組細胞PCA和PLS-DA分析二維及三維得分散點圖對比結果(a): PCA二維散點圖； (b): PLS-DA二維散點圖； (c): PCA三維散點圖； (d): PLS-DA三維散點圖Fig.2 Two-dimentional and three-dimentional score scatter figurecomparison of PCA and PLS-DA result of the four groups(a): PCA two-dimentional score scatter figure； (b): PLS-DA two-dimentional score scatter figure； (c): PCA three-dimentional score scatter figure； (d): PLS-DA three-dimentional score scatter figure

圖3 四組細胞PCA和PLS-DA分析對比結果(a): PCA柱狀圖； (b): PLS-DA柱狀圖； (c): PCA載荷折線圖； (d): PLS-DA載荷折線圖； (e): PCA載荷柱狀圖； (f): PLS-DA載荷柱狀圖； (g): PCA聚類分析圖； (h): PLS-DA聚類分析圖Fig.3 Comparison of PCA and PLS-DA result of the four groups(a): PCA column figure； (b): PLS-DA column figure； (c): PCA loading line figure； (d): PLS-DA loading line figure； (e): PCA loading column figure； (f): PLS-DA loading column figure； (g): PCA cluster figure； (h): PLS-DA cluster figure

2.3 四種急性白血病細胞兩兩組合主成分分析結果

為進一步驗證四種細胞的譜峰差別，比較兩種分析模型的差異，將四種細胞兩兩組合進行有監督PCA并分析擬合參數情況。 如圖4、圖5所示，四種細胞被兩兩成功區分，PCA擬合參數如表2所示。 PCA模型的R2X參數值處于0.43～0.581區間范圍內，表示模型對光譜數據信息具備一定概括能力； 但Q2參數值處于0.093 6～0.163區間范圍內，表示模型可預估精確程度低，模型的總體效果不甚理想。

2.4 四種急性白血病細胞兩兩組合偏最小二乘判別分析結果

按前文所述方法將四種細胞兩兩組合進行PLS-DA并分析擬合參數情況。 如圖6、圖7所示，四種細胞被兩兩成功區分，PLS-DA擬合參數如表3所示。 模型R2Y處于0.91～0.996區間范圍內，Q2參數值處于0.706～0.94區間范圍內，表明該模型能描述因變量的變異信息和模型可預估精確程度很理想，基本滿足四種白血病細胞兩兩區分的辨別要求。 Jurkat vs THP-1和 KG-1α vs NB4兩個組合中模型R2X參數值較低，可能是由于這兩組中兩類細胞的光譜相似性較高，需要更多的主成分來表征它們的信息內容，因此模型概括第一、第二主成分的信息比重較少。

圖4 四組細胞兩兩組合PCA二維得分圖Fig.4 Two-dimentional score figure for PCA model from two combinations of the four groups

圖5 四組細胞兩兩組合PCA三維得分圖Fig.5 Three-dimentional score figure for PCA model from two combinations of the four groups

圖6 四組細胞兩兩組合PLS-DA二維圖Fig.6 Two-dimentional score figure for PLS-DA model from two combinations of the four groups

圖7 四組細胞兩兩組合PLS-DA三維圖Fig.7 Three-dimentional score figure for PLS-DA model from two combinations of the four groups

表2 四組細胞兩兩組合PCA模型質量參數Table 2 Model quality parameter for PCA model fromtwo combinations of the four groups

表3 四組細胞兩兩組合PLS-DA模型質量參數Table 3 Model quality parameter for PLS-DA modelfrom two combinations of the four groups

通過載荷分析，jurkat細胞在708，957和1 243 cm-1峰高于KG-1α細胞，在789和920 cm-1峰低于KG-1α細胞[圖8(a)]。 jurkat細胞在826，842，957，971，1 155，1 243，1 313，1 547和1 596 cm-1峰高于NB4細胞，在920 cm-1峰低于NB4細胞[圖8(b)]。 jurkat細胞在966，1 118，1 206，1 230和1 240 cm-1峰高于THP-1細胞，在759，842，1 031，1 050，1 485和1 538 cm-1峰低于THP-1細胞[圖8(c)]。 KG-1α細胞在826，844，962，1 119，1 155，1 206，1 548和1 596 cm-1峰高于NB4細胞，在1 227和1 243 cm-1峰低于NB4細胞[圖8(d)]。 THP-1細胞在708，842，957，1 031，1 050，1 155，1 240和1 485 cm-1峰高于KG-1α細胞，在789，826，920，966，1 206，1 258和1 415 cm-1峰低于KG-1α細胞[圖8(e)]。 THP-1細胞在826，844，957，1 050，1 155和1 313 cm-1峰高于NB4細胞，在920，1 258和1 415 cm-1峰低于NB4細胞[圖8(f)]。 歸納上述兩兩組合載荷分析得知，jurkat細胞的羥基磷灰石/類胡蘿卜素/膽固醇(957 cm-1)含量高于其他細胞，且蛋白(1 243 cm-1)含量較高，反映了淋巴細胞活躍的增殖代謝； KG-1α細胞的核酸(789 cm-1)、葡萄糖/乳酸(920 cm-1)和羥脯氨酸/酪氨酸(1 206 cm-1)含量高于其他細胞，且羥基磷灰石/類胡蘿卜素/膽固醇(957 cm-1)含量較低，反映了其活躍的與核酸相關的能量代謝； NB4細胞的葡萄糖/乳酸(920 cm-1)含量較高，且核酸(826 cm-1)、膠原/脂質(1 313 cm-1)、羥基磷灰石(962 cm-1)和蛋白(1 155和1 548 cm-1)含量少于其他細胞，反映了其可能存在較強的細胞呼吸； THP-1細胞的羥基磷灰石/類胡蘿卜素/膽固醇(957 cm-1)含量較高，且核酸(1 415 cm-1)含量少。

圖8 四組細胞兩兩組合PLS-DA載荷分析圖Fig.8 Loading figure for PLS-DA model from two combinations of the four groups

圖10 四組細胞兩兩組合PLS-DA模型下聚類分析圖Fig.10 Dendrogram of cluster analysis from two combinations of the four groups using PLS-DA

2.5 四種急性白血病細胞兩兩組合聚類分析結果

運用前文所述方法從4類細胞拉曼光譜結果中隨機抽取40張特征光譜(每類10張)，組合而成四組數據資料。 由圖9、圖10可知，PCA模型下特征光譜聚類分析存在偏差，部分分組中兩類細胞被區分為兩類以上結果。 相比之下，PLS-DA模型下聚類分析能很好地將四種細胞特征光譜兩兩區分，準確度可達100%。

外周血白細胞分析是血液系統疾病診斷檢查中的關鍵步驟，并且通常需要分子標記。 只有詳細的表型分析才能識別細胞的特定病理階段，如白血病。 細胞的固定和化學染色對于提供對細胞生化特性的更深入了解是必要的，然而，這種標記方法不允許科研人員研究其生理生化狀態下的細胞行為。 拉曼光譜技術以其非標記無損檢測的優勢，彌補了流式細胞術、免疫組化、細胞遺傳學和分子生物學對白血病細胞分析方法的不足，提供了一種操作簡便、價格低廉的白血病細胞生物學信息的表征方式。 本研究的目的是使用拉曼光譜技術鑒別來自四種不同白血病細胞系的白血病細胞的光譜差異，并使用這些差異來區分這四種細胞。

3 結 論

采用PCA與PLS-DA特征光譜分析相比較的方法，鑒別不同的急性白血病細胞。 雖然這些分析技術借助視覺上可描述的分數圖提供了復雜數據集的低維表示，但是從分數圖中推測顯微拉曼技術所展示的細胞生物學相關結論，還需依靠科研工作者的的主觀檢驗。 在上述化學計量學方法基礎上，聚類分析佐證了PLS-DA方法的可行性和穩定性。

綜上，共聚焦顯微拉曼光譜技術與PCA、PLS-DA和聚類分析等特征光譜分析方法緊密結合，可以科學檢測四種急性白血病細胞內生物大分子結構、組分及含量的差異，并可以以這些差別為依據鑒別不同類型的急性白血病，具有深遠的科研和臨床意義。