基于熒光光譜技術的異槲皮素抑制晚期糖基化產物形成的機制研究

張 露, 徐 亮, 涂宗財, 2*, 周祺溟, 周雯娜

1. 江西師范大學生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌 330022 2. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047

引 言

糖基化反應，又叫美拉德反應，是還原糖的醛基和蛋白質、核苷酸和脂質的氨基之間發生的一種自發的非酶促反應[1]，通常包括初期、中期和晚期三個階段，最后會形成一系列晚期糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)。 在食品加工工業，常通過糖基化反應提高蛋白質的功能特性(如起泡性、乳化性、抗氧化性等)，改善食品的風味、色澤和口感[2-3]。 但食品體系或食品蛋白在糖基化過程中也會形成對人體有害的AGEs，降低氨基酸的營養價值[4]。 研究發現，堅果、谷類產品、高溫加工的罐頭產品、烤肉、餅干和蛋糕通常含有相對較高的AGEs[1]。 長期攝入富含AGEs的食物，會導致AGEs在機體中的積累，加速血管中膠原蛋白的交聯，促進活性氧和活性碳自由基的形成，增強胰島素抵抗，促進促炎癥反應等，從而增加阿爾茨海默病、糖尿病、炎癥、心血管疾病、視網膜病變等系列慢性疾病的發病率[5]。 添加AGEs抑制劑降低食品在熱加工過程中AGEs的形成是提高食品安全，促進人體健康的有效方法之一。

AGEs抑制劑包括合成和天然化合物兩類，其中植物來源的天然AGEs抑制劑因其種類多、效果較好、副作用小等優點已成為國內外的研究熱點[6]。 Oral等[7]研究發現，石榴皮提取物、歐洲布什蔓越莓汁提取物、咖啡酸、兒茶素、鞣花單寧等植物提取物和多酚類化合物可有效降低餅干焙烤過程中呋喃和丙烯酰胺的形成； 添加0.2%的白藜蘆醇、表兒茶素和迷迭香酸，可使餅干中熒光性AGEs的形成量降低28.60%～62.05%[8]。 異槲皮素(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)是普遍存在于植物中的功能性次級代謝產物，具有降血壓、抗氧化、保肝、抗增殖、抗利尿、抗癌等多種生物活性[9]，前期研究發現，槲皮素能有效抑制BSA-葡萄糖體系在37 ℃條件下的糖基化反應，降低AGEs的形成，但糖苷形式的槲皮素——異槲皮素，能否有效抑制食品蛋白在熱處理條件下的糖基化反應需進一步研究。

近年來，熒光光譜法因其具有靈敏度高、選擇性強、樣品用量少、操作簡便，同時又可以提供較多的物理參數的特點，廣泛應用于小分子和蛋白質的相互作用研究。 因此本文以α-La-果糖體系為研究模型，通過分析熒光性AGEs相對含量的變化，研究熱處理條件下，異槲皮素對α-La-果糖體系糖基化反應的影響，然后通過內源熒光、同步熒光和三維熒光光譜技術研究異槲皮素對α-La的構象結構、微環境的影響及其相互作用機制，最后從α-La結構變化和分子間相互作用的角度探討異槲皮素抑制α-La糖基化的機制。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

果糖、異槲皮素(北京索萊寶科技有限公司)； NaH2PO4和Na2HPO4(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)； α-La(美國Sigma公司)。

F-7000熒光光譜儀(日本日立公司)； 天平FA1104N電子分析天平(丙林電子科技有限公司)； PE28 PH計(梅特勒-托力多儀器(上海)有限公司)。

1.2 糖基化α-La制備

根據文獻[10]報道方法制備糖基化體系。 采用0.2 mol·L-1、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制20 mg·mL-1的α-La和果糖溶液。 α-La和果糖溶液按等體積比加入帶蓋玻璃瓶中，然后分別加入不同濃度的異槲皮素溶液，使反應體系中異槲皮素的濃度分別為12.20，24.39，36.58，48.78和73.17 μmol·L-1。 用乙醇代替異槲皮素和用PBS代替果糖的反應體系分別設為控制組和樣品空白組。 最后，所有混合體系于55 ℃下反應36 h，4 ℃冷卻后，測定其熒光性AGEs的相對含量。

1.3 熒光光譜分析

1.3.1 AGEs抑制活性測定

采用日立F-7000熒光光譜儀測定樣品中熒光性AGEs的相對含量[10]。 樣品用0.2 mol·L-1、pH 7.4的PBS稀釋6倍后測定其在激發波長370 nm，發射波長440 nm處的熒光強度，激發和發射波長的狹縫寬度均設為2.5 nm，掃描速度為1 200 nm·min-1。 AGEs抑制率的計算公式為

(1)

其中FIs為含有α-La、果糖和異槲皮素的反應體系的熒光強度；FIc，FIb和FInb分別為控制組、空白組和樣品空白組的熒光強度。

1.3.2 內源熒光光譜

采用日立F-7000熒光光譜儀測定α-La內源熒光光譜的變化[11]，掃描參數為： 激發波長，280 nm； 發射波長，300～400 nm； 激發和發射波長的狹縫寬度，5.0 nm； 掃描速度，1 200 nm·min-1。 測定前用0.2 mmol·L-1，pH 7.4的PBS將所有樣品稀釋30倍。

1.3.3 同步熒光光譜

采用日立F-7000熒光光譜儀分析298 K條件下不同濃度異槲皮素對α-La同步熒光光譜的影響。 波長間隔(Δλ)為15 nm時的掃描范圍為260～350 nm，Δλ為60 nm時的掃描范圍為250～350 nm，激發和發射波長的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為1 200 nm·min-1，α-La的濃度為0.3 mg·mL-1，異槲皮素的濃度范圍為0.0 ～25.97 μmol·L-1。

1.3.4 三維熒光光譜

根據前期研究方法[12]，2.0 mL 0.3 mg·mL-1的α-La與10 μL 0.5 mmol·L-1的異槲皮素在25 ℃下混勻后，靜置5 min，然后測定其在激發和發射波長掃描范圍均為200～600 nm時的熒光光譜，激發和發射波長的狹縫寬度均為5.0 nm，掃描速率為12 000 nm·min-1。

1.3.5 抑制動力學研究

采用熒光滴定的方法[13]，分別測定298, 304和310 K時，不同濃度異槲皮素對α-La在300～400 nm范圍內的熒光發射光譜的影響。 激發波長為280 nm，激發和發射狹縫寬度為5.0 nm, 掃描速度為1 200 nm·min-1。 混合體系中，α-La的濃度為0.3 mg·mL-1，異槲皮素的濃度從3.32 μmol·L-1增加到25.97 μmol·L-1。

2 結果與討論

2.1 AGEs抑制能力分析

蛋白糖基化過程中形成的AGEs包括熒光性AGEs和非熒光性AGEs組成，因此，很多研究者采用熒光光譜技術評價樣品抑制蛋白糖基化過程中AGEs形成的能力，熒光強度越高，表明反應體系中AGEs形成的相對含量越高，抑制率就越低。 異槲皮素對α-La-果糖體系中AGEs形成的影響如圖1所示，當異槲皮素的濃度為12.20，24.39，36.58，48.78和73.17 μmol·L-1時，其對AGEs形成的抑制率分別為11.97%，54.79%，74.66%，78.90%和86.25%，而陽性對照品氨基胍鹽酸鹽在濃度為24.39和36.58 μmol·L-1時，對AGEs形成的抑制率為38.21%和58.72%，低于異槲皮素，表明異槲皮素能有效抑制α-La糖基化過程中AGEs的形成。

圖1 異槲皮素對α-La-果糖體系中AGEs形成的影響

2.2 內源熒光光譜分析

異槲皮素對糖基化α-La內源熒光強度的影響如圖2所示。 天然α-La具有最大熒光強度，糖基化后α-La的熒光從3 386降低至2 357。 說明糖基化反應能顯著降低了α-La的內源熒光，可誘導蛋白構象的展開，降低其內源熒光強度[14]。 但隨著異槲皮素濃度從12.20 μmol·L-1增加到48.78 μmol·L-1時，糖基化α-La的內源熒光強度也逐漸增強，說明異槲皮素能夠降低糖基化反應誘導的α-La構象變化，這可能是其抑制AGEs形成的原因之一。 Zhang等也表明，緩解糖基化誘導的蛋白構象變化是天然提取物[10]和黃酮類化合物[11]抑制蛋白糖基化的機制之一。 但當樣品濃度為73.17 μmol·L-1時，最大熒光強度值出現下降，這可能是因為黃酮類化合物本身可與蛋白發生相互作用，猝滅其內源熒光。 當黃酮的相對濃度過高的時候，α-La的糖基化反應被完全抑制，反應體系中多余的黃酮類化合進一步猝滅蛋白質的的熒光，改變其構象。

圖2 不同濃度異槲皮素對糖基化α-La內源熒光光譜Fig.2 Influence of isoquercetin on the intrinsicfluorescence spectra of glycated α-La

2.3 同步熒光光譜分析

同步熒光光譜可以檢測蛋白質的主要熒光性發色團苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，激發波長為280 nm時，蛋白質的熒光強度主要來源于色氨酸，其次為酪氨酸，因此，可以通過同步熒光光譜技術分析異槲皮素對α-La中熒光性氨基酸殘基附近微環境變化的影響。 如圖3所示，Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時的最大熒光發射光譜的變化分別反應酪氨酸和色氨酸微環境的變化。 酪氨酸[圖3(a)]和色氨酸[圖3(b)]殘基的最大熒光強度均隨著異槲皮素濃度的增加而明顯降低，其中對色氨酸的熒光猝滅效果明顯高于酪氨酸，其熒光強度分別從1 213和6 925降至827.4和3 700。 另外，色氨酸的最大發射波長出現了紅移現象，而酪氨酸的最大發射波長沒有明顯的變化。 以上結果表明，α-La的熒光猝滅的主要貢獻者是色氨酸，異槲皮素與α-La的結合會改變色氨酸微環境的極性，使其暴露在更加親水的環境中，增加其周圍微環境的親水性[13]。 這可能是因為色氨酸比酪氨酸對其周圍極性的變化更敏感，如芹菜素、柚皮素、山柰酚和染料木素與β-乳球蛋白的相互作用使色氨酸的熒光發射波長發生紅移，但是對酪氨酸的最大發射波長無影響[15]。

2.4 三維熒光光譜分析

三維熒光光譜技術可以研究蛋白質的構象變化。 異槲皮素對天然α-La的三維熒光光譜的影響如圖4所示，Rayleigh(Ex=Em)峰是瑞利散射峰，峰1(Ex=280 nm，Em=330 nm)為色氨酸殘基的分光特性峰，主要表明蛋白質的多肽骨架結構的變化。 從圖4(a)和(b)可以看出，α-La與異槲皮素相互作用后，Rayleigh峰和峰1的熒光強度顯著降低，這可能歸因于色氨酸熒光團微環境的變化以及α-La內多肽骨架結構的變化[13]。

圖3 α-La與不同濃度異槲皮素作用的同步熒光光譜

2.5 抑制動力學分析

2.5.1 熒光猝滅動力學

熒光光譜是研究小分子配體和蛋白受體間相互作用的強有力的工具，已廣泛被用于研究生物大分子和小分子間的相互作用機制[13, 15]。 由圖5(a)所示，α-La的熒光強度隨異槲皮素濃度的增加逐漸降低，且發射波長出現了明顯的藍移，表明異槲皮素改變了α-La的構象結構，有效猝滅了α-La的內源熒光，其熒光猝滅機制可通過Stern-Volmer方程計算

(2)

式(2)中，F和F0分別為含和不含異槲皮素時α-La的熒光強度; [Q]是異槲皮素的濃度;Kq為熒光猝滅速率常數;KSV為Stern-Volmer猝滅常數;τ0為沒有猝滅劑的情況下α-La的平均熒光壽命。

以異槲皮素濃度[Q]為橫坐標，F0/F為縱坐標繪制的Stern-Volmer曲線如圖5(b)所示，根據方程計算的KSV和Kq如表1所示，KSV隨著反應溫度的升高而降低，Kq在298，304和310 K時的值分別為6.07×1012，5.33×1012和5.14×1012L·mol-1·s-1，且遠高于生物大分子最大擴散碰撞猝滅常數(2×1012L·mol-1·s-1)，表明異槲皮素是通過靜態方式猝滅α-La的內源熒光[16]。

圖4 異槲皮素對α-La三維熒光光譜的影響Fig.4 Three-dimensional fluorescence spectra of α-La without (a) and with (b) isoquercetin

圖5 (a)不同濃度異槲皮素對α-La熒光發射光譜的影響； (b)F0/F與異槲皮素濃度[Q]之間的Stern-Volmer圖； (c)log[(F0-F)/F]與log[Q]的double logarithmic圖； (d)lnKa與1/T的van’t Hoff圖

2.5.2 結合常數和熱力學參數

基于靜態猝滅機理，可采用double logarithmic方程(3)計算結合常數Ka和結合位點數n

(3)

結合常數Ka和結合位點n如表1所示，異槲皮素和α-La的Ka值隨溫度升高逐漸減小，并且與KSV的變化一致，說明隨溫度的升高，異槲皮素-α-La復合物的穩定性降低，說明異槲皮素與α-La的結合是一個放熱的過程。 結合位點數n分別為1.368，1.472，1.128，接近于1。 說明異槲皮素在α-La上是只有一個或者一類結合位點的[13]。

用van’t Hoff方程計算熱力學參數中的焓變(ΔHo)，熵變(ΔSo)和自由能變化(ΔGo)來研究異槲皮素-α-La復合物的形成過程中的熱力學變化，即

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R

(4)

ΔGo=ΔHo-TΔSo

(5)

其中R是氣體常數(8.314 J·mol-1·K-1)，T是實驗溫度(288，298和310 K)，Ka是通過式(2)得到的結合常數。 根據方程(4)繪制以lnKa為縱坐標，以1/T為橫坐標的直線[圖5(d)]，得到的ΔHo，ΔSo和ΔGo如表1所示。 根據文獻報道，ΔHo<0，ΔSo<0表明氫鍵和范德華力是分子間的主要作用力； ΔHo>0，ΔSo>0表明疏水相互作用是分子間的主要作用力； ΔHo>0，ΔSo<0表明靜電相互作用是分子間的主要作用力[15]。 異槲皮素與α-La相互作用的ΔHo和ΔSo分別為-458.79和-1.39 kJ·mol-1，均小于0，且|ΔHo|<|TΔSo|，這進一步驗證了異槲皮素與α-La的結合是一個放熱的過程，范德華力和氫鍵是其主要驅動力。 另外，ΔGo<0，表明異槲皮素-α-La復合物的形成是一個自發的過程[16]。

表1 槲皮素與α-La相互作用的熒光猝滅常數、結合位點數、結合常數和熱力學參數Table 1 The fluorescence quenching constants, binding sites, binding constant andthermodynamic parameters for the interaction of isoquercetin with α-La

3 結 論

通過熒光光譜技術研究了異槲皮素抑制α-La-果糖模型中AGEs形成的能力。 研究結果表明，異槲皮素可以顯著抑制α-La糖基化過程中AGEs的形成，減弱糖基化反應誘導的α-La構象變化。 同時，異槲皮素與α-La的相互作用會顯著猝滅α-La的內源熒光，改變α-La的構象，使色氨酸暴露在更加親水的環境中，增加其微環境的極性。 分子間相互作用研究發現，異槲皮素與α-La作用后按照1∶1的摩爾比結合形成了穩定的復合物，且通過靜態的方式猝滅α-La熒光團； 異槲皮素-α-La復合物的形成是一個自發的放熱過程，范德華力和氫鍵是其主要作用力。 本研究結果證明，異槲皮素可作為天然的糖基化抑制劑用于食品加工工業，減少食品熱加工過程中AGEs的產生，提高食品的營養品質和安全性。