雌激素作用下神經干細胞移植治療創傷性腦損傷的研究進展

梁雨婷 胡悅 趙安琪 王沐榕 孫建 李力卓

以往大量研究表明，雌激素可以發揮與生殖系統、非生殖系統相關的生理作用，在機體生長發育過程中參與激活、形成神經通路以及構建中樞神經系統網絡，同時雌激素也可對神經系統內細胞程序性死亡等方面進行調節[1]。人類主要的雌激素是17β-雌二醇（17β-estradiol，E2），卵巢內膽固醇是合成雌激素的主要前體。而在大腦內，雌激素是雄激素經芳香酶的作用轉變合成的，同時雌激素也可經神經細胞自身合成。這些局部合成的雌激素對神經元和突觸的形成發揮著極為重要的作用，同時對神經干細胞（neural stem cells，NSCs）分化成為神經元也有重要的調控作用。目前，關于NSCs 移植治療創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的研究已有一定的進展和發現，為臨床實施TBI 治療手段和途徑的創新提供了良好的開端。本文將從雌激素對NSCs 的控制作用、雌激素對NSCs 分化方向的調控作用、NSCs 移植治療TBI 的臨床應用以及雌激素治療TBI 的臨床應用等方面展開綜述。

一、雌激素對NSCs 的控制作用

（一）雌激素作用下NSCs 可發育為神經元

NSCs 是一類具有多向分化潛能并且能夠自我更新、無限增殖的細胞。E2 影響神經細胞的生長和分化、各級突觸的形成及相關激素和神經遞質受體的合成，從而導致中樞神經系統結構的永久性改變[2]。NSCs 在E2 的作用下可分化為神經元[3]。E2 主要通過與雌激素受體（estrogen receptors，ERs）的結合對NSCs 發揮其生物學效應。ERs 包括α 亞型和β 亞型，這2 種受體亞型在腦內的分布具有腦區特異性[4,5]。相關研究發現，E2 主要通過與ERβ 結合促進人類神經前體細胞的增殖，E2 與ERβ 結合后誘導ERβ 激活，經pERK 信號通路觸發細胞內DNA 復制、細胞中心體擴增使前體細胞增殖[6]。此外，ERβ 的激活啟動DNA、中心體復制，使細胞周期進入S 期和DNA 分離。同時E2 還可促進海馬NSCs 增殖，當其濃度為10-8mol/L 時，細胞增殖的數量最多，E2 濃度逐漸增加后，在細胞增殖過程中，NSCs 可同時表達ERα 和ERβ[7]。據此推斷，E2 在促進NSCs 增殖、分裂分化為神經元的過程中是通過ERα 與ERβ 結合后同時發揮作用的，即E2 與ERα 和ERβ 結合形成的激素-受體復合物激活受體DNA 上特異的激素反應元件，互相作用后調節靶基因的表達。除此之外，還可通過非基因組機制，如E2 通過與G 蛋白相偶聯的膜通道受體等發揮生理效應[8]。

（二）雌激素作用下NSCs 分化后的神經元突觸增加

給予去勢的雌性大鼠定量E2 后，海馬CA1 區錐狀神經元的興奮性樹突密度增加，且在新生的興奮性樹突上有新突觸形成，新生突觸長度變短而分枝數目增加[9]。Murphy 和Glanzman[10]的研究結果證實，E2 誘導興奮性樹突上的新突觸形成可被N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體阻斷劑阻斷。側面說明E2 使海馬CA1 區NMDA 受體密度增加可能是形成海馬CA1 區內興奮性突觸的重要條件之一。各種損傷后的軸突和突觸再建可促進損傷后的神經修復，使神經系統功能得到充分改善。突觸素（synaptophysin，SYP） 是一種位于突觸前囊泡上與突觸結構和功能密切相關的鈣結合蛋白，其幾乎存在于外周和中樞神經系統的所有神經末梢上，參與發生突觸、釋放神經遞質以及導入、轉運、再循環利用突觸囊泡[11]。雌激素可間接影響SYP 進而使突觸發生和形成，是突觸結構與功能完整的重要生化物質基礎。近年研究發現，小劑量的E2 可上調樹突的肌動蛋白F-actin，控制與神經元樹突形態、結構、運動密切相關的上游調控因子，使樹突的長度、密度和運動性增加，同時NMDA 受體磷酸化增加；E2 較長時間的積累抑制突觸發生的同時可抑制神經元樹突的密度，使樹突上突觸密度減小[12]。由此推斷，小劑量的E2 在促進NSCs 增殖、分裂、分化為神經元后，樹突的長度、密度、運動性增加，同時可減輕突觸受損、促進突觸重建，而大劑量或長時間的E2 累積可抑制樹突和突觸發育，繼而神經元受損，影響動物大腦的發育過程，神經系統功能惡化導致成年后記憶、認知、感覺等行為的異常。雖然在E2 的作用下決定NSCs 分化結果的分子機制尚未徹底研究透徹，但可以肯定的是，多種特異性的受體及生長因子之間的互相作用決定了NSCs 的分化結果[13]。同時，E2 控制NSCs 的增殖、分化，在大鼠的整個神經系統發育過程中起著不可比擬的作用。

二、雌激素對NSCs 分化方向的調控作用

（一）雌激素對5-羥色胺能神經元的作用

E2 主要通過與ERs 結合對5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神經元發揮作用[14]。相關研究表明，NSCs 在一定條件下可被定向誘導分化為5-HT 能神經元，并且同時表達ERα和ERβ[15]。目前普遍認為，ERα 主要在海馬回介導，而ERβ則在基底前腦、中縫背核高濃度分布。Gundlah 等[16]對去勢恒河猴的研究結果發現，ERβ mRNA 中縫背核5-HT 能神經元表達ERβ mRNA 的同時可被翻譯成相應的蛋白，而且不論是ERβ mRNA 還是ERβ 蛋白表達，有或無E2，治療組都表現出極其相似的表達濃度，因此介導恒定表達的ERβ 受體促使細胞核內某些基因的轉錄如TPH、5-HT 受體基因等，繼而受體基因轉錄后表達為有功能的蛋白質，從而影響5-HT能神經元神經遞質的傳遞功能，可能是E2 對5-HT 能神經元的作用途徑之一。

E2 也可作用于5-HT 受體，調節5-HT 能神經元的功能。5-HT 受體有許多不同的亞型，5-HT1A、5-HT2A 和5-HT2C 則是目前為止研究較多的5-HT 受體亞型。Lu 和Bethea[17]對去勢恒河猴的E2 治療組與空白對照組的治療結果比較后發現，空白對照組位于中縫背核的5-HT1A 自身受體結合下調，同時位于下丘腦的神經元突觸后5-HT1A 受體結合位點下調。激素替代治療后的突觸后5-HT2A 受體增多，而突觸前5-HT1A 自身受體減少，因而促進5-HT 能神經元的功能，與5-HT 能神經元功能相關疾病的輕躁狂、激越、意識混亂、定向障礙等癥狀從而得到改善。

（二）雌激素對多巴胺能神經元的作用

一定條件下E2 可誘導NSCs 分化為多巴胺（dopamine，DA）能神經元，為NSCs 移植治療帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）提供了理論基礎[18]。相關研究發現，乙酰膽堿或γ-氨基丁酸可體外調節作用于DA 能神經元末梢的突觸前膜，以此控制DA 的釋放[19]。E2 也可直接影響紋狀體乙酰膽堿和γ-氨基丁酸的活性，進而直接作用于DA 能神經元末梢，使DA 釋放增加，PD 患者癥狀改善。

E2 不僅可調節DA 能神經元，還對其有神經保護作用。早在1977 年Bedard 等[20]提出E2 可作為神經保護劑抵抗紋狀體DA 能神經元病變的觀點。給予去卵巢雌鼠定量E2 后，可使應用神經毒性物質1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropy ridine，MPTP）導致的細胞死亡減少且紋狀體DA 的含量減少得到改善。但是E2 的長時間應用最終會導致DA 能神經元耗竭、DA 釋放減少以致癥狀加重。除此之外，正常雌鼠補充E2 后并不能使其免受MPTP 的神經毒性作用甚至神經系統功能紊亂[21]。由此可見，低水平的E2 可對DA 能神經元提供神經保護作用，而長時間的E2 使用并不能削弱MPTP 對紋狀體DA 能神經元的細胞毒性作用。ERs 位于PD 患者DA 能神經元稀少的中腦中央灰質區，這一發現表明E2 可能在中腦中央灰質區為DA 能神經元提供神經保護作用。同時E2 可通過影響DA 轉運物質減少神經毒性物質MPTP 重吸收，發揮神經保護作用，使DA 能神經元免受毒害甚至死亡[22]。E2 還可與神經營養因子協同作用而發揮其神經保護功能，同時作為抗氧化物質抵抗氧自由基的毒性作用[23]?？傊?，雌激素通過上述的諸多因素及環節促進了NSCs 向5-HT 能神經元、DA 能神經元的分化，為利用雌激素“潤色”NSCs 移植治療相關腦部疾病提供了有力證據。

三、NSCs 移植治療TBI 的臨床應用

（一）NSCs 移植類型的選取

自身NSCs 提取并經體外的細胞培養、擴增后進行移植具有較高的存活率，并且可避免移植后發生的免疫排斥反應。但自體NSCs 提取是有創的，會給機體帶來巨大負擔，加重腦損傷區域和周圍水腫帶細胞的損傷，嚴重的甚至會直接導致機體的死亡[24]。高速發展的克隆技術可解決這一問題帶來的危害，但由于該技術操作過于繁雜、耗時過長、成本過高，且存在一定醫學倫理的限制，因此目前難以得到廣泛的普及和應用。異體的NSCs 移植目前研究較多，其優勢包括：（1）異體NSCs 移植后可在機體內長期生存并分化為神經元，這一觀點已在相關動物實驗結果中得到證實[25]；（2）異體NSCs 移植也可直接參與神經再生作用或分泌型神經營養因子，促進其參與神經修復作用使受損的神經功能獲得提升[26]；（3）異體NSCs 移植能改善機體運動功能的同時還能明顯使其認知功能好轉[27]。

目前異體NSCs 移植的一大問題是NSCs 在受損區域環境下的低生存率和保留率。除了受損區域的微環境直接被改善外也可在受損區域搭建一個適合NSCs 遷移及留存的新細胞骨架[28]。建立TBI 大鼠模型后，將NSCs 與透明質酸-膠原骨架中的bFGF 緩釋系統（bFGF sustained release system,bFGFCRS） 共同移植到受損區域后發現，外源性NSCs 被bFGFCRS 作用后分化為神經元顯著增高，并且新生神經元的突觸與宿主腦組織原有的突觸形成都增加。這些結果顯示，bFGFCRS 的搭建為異體植入的NSCs 創造了良好的微環境，并且有利于神經組織的再生和機能恢復。使用HA-Lm 膠作為bFGF-CRS 的介質，觀察到NSCs 在移植區域內的留存時間得到顯著延長（＞3 d），且神經前體細胞向損傷區域周圍的遷移率上升了20%[29]。

（二）移植部位和時間的選擇

TBI 后腦組織可發生受損區域周圍組織水腫、神經元死亡以及相關的炎癥反應，尤其是小膠質細胞可在TBI 早期被誘導激活后發揮巨噬細胞樣功能，產生相應細胞毒性效應，產生免疫調節因子和炎性介質對神經通路網絡進行更改，促進損傷神經元凋亡、突觸的剝離，繼而影響神經修復性重組以及神經通路信息的傳遞[30,31]。雖然小膠質細胞的激活影響NSCs 移植后的遷移、存活、增殖以及分化，但與小膠質細胞相關的NSCs 也會調節其活動和功能，兩者相輔相成、相互作用、相互影響[32]。促炎因子、炎性介質、興奮毒性神經遞質以及自由基在TBI 急性期（傷后3 h～3 d）大量釋放，繼而產生氧化應激反應及神經毒性作用，這些均可影響NSCs 移植的生存率和留存率[33]。Lee 等[34]將NSCs 移植到腦出血模型大鼠的受損區域后發現，超急性期（傷后3 h）移植NSCs 可減少早期受損區域神經元的凋亡、減少周圍水腫帶腦組織水腫的形成及炎性介質的浸潤，這說明NSCs 具有抗炎和免疫調節作用。Shear 等[25]以CCI 動物模型為基礎，將NSCs 立體定向移植到對側皮質區或受傷側紋狀體，分別在傷后第2、7、14 天進行行為學的檢測和評估，研究結果發現：（1）外傷后2～7 d 是最佳的移植時間；（2）移植到損傷區域鄰近的大腦皮層或紋狀體的NSCs 存活率和向損傷區域定向遷移的能力增強，大鼠的平衡運動系統也能得到部分改善。

（三）NSCs 移植治療TBI 存在的問題

大量實驗數據證實，NSCs 移植對治療TBI 有一定成效，但其作用機制較為復雜，仍然需進一步的研究發現和探討[35]。筆者認為，未來的研究應著重于以下幾個問題與方向：（1）如何精確調控植入的NSCs 使其在腦內具有更高的存活率，并能精準地向損傷區遷移，定向分化以修復受損的神經組織，恢復腦功能；（2）探索最佳的NSCs 移植方式、移植時間、移植部位、移植數量以及移植后應持續的治療以降低并發癥的產生；（3）NSCs 移植后產生的致畸性、致瘤性、免疫排斥反應等相關并發癥。

總之，NSCs 移植能從細胞水平上對受損的神經元、周圍組織進行保護和修護，為TBI 的治療提供了新的想法和新的思路。隨著對NSCs 移植的深入研究，相信不久的將來就可以實現動物實驗向臨床治療的轉化，使其成為TBI 治療的重要手段之一。

四、雌激素治療TBI 的臨床應用

目前大多數關于TBI 的研究表明動物的預后存在明顯的性別差異，雌性動物的預后往往比雄性要好[36]。以往的研究表明，TBI 后動物創傷部位E2 的水平會增加，并且E2 的增加能夠降低顱內壓、減輕腦水腫、增加腦灌注壓，最終使TBI后動物發生嚴重不良后果的幾率大大降低[37]。由此可見，E2對于TBI 后具有明顯的神經保護作用。

TBI 后機體免疫功能紊亂，同時會使機體對創傷的敏感性大大增加。TBI 導致的機體免疫失調過程是極其復雜的，包括TBI 后釋放促炎因子與抗炎因子和抑制各種細胞介導的免疫應答[38]。Slowik 和Beyer[39]通過實驗觀察到E2 可通過ER作用于TBI 后小鼠創傷部位初始免疫細胞miRNA 上游的免疫監視序列，使其免疫監視功能增強。由此可見，E2 對TBI 后所導致的免疫失調發揮重要的調節作用。此外E2 還會發揮積極的抗炎作用，減輕TBI 后所導致的中樞炎性損傷。機體遭受TBI 時，促炎因子的過量釋放導致腦水腫加重和神經元損傷[40]。雖然TBI 后所導致的炎癥反應是病情加重的關鍵因素，但E2 對于TBI 后的炎癥反應具有明顯抑制作用。

目前的研究結果多數是基于動物實驗而發現的，缺乏相關臨床試驗的研究。雌激素作為人體的一種生理激素，其含量也會隨著女性生理周期及年齡增長而發生變化。因此雌激素對于創傷性顱腦損傷的療效會存在個體差異化，在臨床工作中應該根據患者具體病情及相關指標結合判斷創傷性顱腦損傷的嚴重程度，制定個性化診療方案。

五、小結與展望

一定濃度的雌激素可促進NSCs 增殖并調控NSCs 的分化方向，使其分化成神經元。神經元數量增多，其興奮性突觸增加，可減輕突觸受損、促進突觸重建，恢復神經網絡的溝通。小劑量的雌激素也可促進NSCs 分化為5-HT 能神經元和DA 能神經元，使其功能得到恢復和改善，發揮良好的神經保護作用使神經元免受凋亡。目前研究發現，建立TBI 大鼠模型后，NSCs 移植治療后外源性NSCs 增殖、定向分化成為神經元對其有良好的神經修復作用。經雌激素預處理的NSCs移植或提早干預患者體內雌激素的濃度后NSCs 移植治療TBI 也許可以發揮良好的臨床效果，幫助患者提早恢復腦功能及認知、感覺、運動功能，減少并發癥的產生，也為未來治療TBI 的臨床手術途徑開創另一種可能性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突