Linifanib對胃癌模型大鼠胃黏膜組織細胞增殖、凋亡及周期分布的影響

黎玉容，彭頌興，楊 兵

深圳市第九人民醫院消化內科，廣東 深圳 518116

胃癌的發病率、病死率均高居十大惡性腫瘤首位，對患者生命安全造成嚴重威脅[1-2]。在我國，中老年人群是胃癌發病的主要群體，隨著社會經濟的發展，日常生活節奏不斷加快，近年來胃癌發病人群出現年輕化趨勢[3]。隨著胃癌癥狀的發生、發展，尋找一種安全有效的治療方法具有重要意義[4]。利尼伐尼(Linifanib)是廣譜的抗血管生成靶向藥物，能夠抑制VEGF、KDR、PDGFR的表達，常用于非小細胞肺癌、原發性肝癌等惡性腫瘤的治療[5]，但關于Linifanib治療胃癌的研究還鮮有報道。本研究擬建立胃癌大鼠模型，使用Linifanib進行干預，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料研究動物：選取35只SD雄性大鼠[濰坊醫學院，許可證號：SCXK(魯)20170003]，月齡(10.1±0.7)個月(9～11個月)；體質量(230.3±6.5)g(221～242 g)。在相對濕度30%～35%、溫度(23.8±1.5)℃的環境中喂養大鼠1周，光照12 h/d。試劑：胃癌細胞株(中國醫學科學院)；阿糖胞苷(天根生化科技有限公司)；Linifanib(武漢欣欣佳麗生物科技有限公司)；大鼠抗兔Bcl-2、Bax抗體(Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠caspase3抗體(Selleck公司)；大鼠抗小鼠p-Akt、mTOR抗體(Hyclone公司)；兔抗小鼠PTEN抗體(Sigma公司)；MTT試劑盒(Gibco公司)；ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模：取5只大鼠作為正常組，不作處理。參照史翠珍等[6]研究中建模方法，并作出適當改動，對其余30只大鼠進行建模，于大鼠腹部皮下注射200 mg/kg阿糖胞苷，2 d后行60 Co照射，于胃癌細胞中添加Ⅰ型胰蛋白酶重懸，取1 ml細胞懸液于大鼠腋部注射，1周后注射部位出現1 cm大小腫塊為建模成功，最終建模成功28只，分為模型組10只、藥物對照組、Linifanib組各9只，正常組、模型組大鼠蒸餾水灌胃，藥物對照組大鼠使用胃復春溶液進行灌胃處理，Linifanib組大鼠使用Linifanib溶液進行灌胃處理。

1.2.2 標本采集：取各組大鼠尾部靜脈血2 ml，2 000 r/min離心處理15 min后分離上清液，置于-80 ℃環境中保存待檢。麻醉處死各組大鼠，取胃黏膜組織，液氮冷凍、固定、石蠟包埋，厚度3 μm，切片。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)檢測胃動素(MTL)、胃泌素(GAS)水平：將血清置于室溫后，標記酶標板，制作標準品，然后取出試劑盒，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應孔上依次加入稀釋好的待測血清和標準品100 μl/孔，置于37 ℃恒溫孵育箱中溫育2 h；用專用的洗滌液將反應板清洗3次后，再加入抗體工作液(1∶100稀釋后)100 μl/孔，置于37 ℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續清洗反應板4次后，在反應孔內加入TMB溶液100 μl/孔，置于37 ℃恒溫孵育箱中溫育45 min后在反應孔內加入終止液100 μl/孔終止反應，在450 nm波長測定吸光度(OD)值，顏色反應深淺與MTL、GAS水平成正比，經繪制標準曲線計算MTL、GAS水平。

1.2.4 免疫組化染色：對待測標本進行脫蠟、水化等處理后，進行高壓修復，并在3%的H2O2的環境下進行培育，15 min后滴入山羊血清進行封閉，在25～27 ℃的環境下孵育0.5 h，之后將封閉液抽離，加入1∶100一抗，將其置于4 ℃的環境中過夜培養，次日加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗，并在恒溫箱中培養0.5 h(恒溫箱溫度37 ℃)，清洗后進行DAB顯色、封片。

1.2.5 細胞增殖檢測：MTT法檢測各組細胞增殖能力。將各組細胞加入96孔板中，每孔加入濃度為5 mg/ml的MTT液30 μl，37 ℃孵育4 h，棄培養液，加入150 μl的DMSO，酶標儀在498 nm波長處檢測每孔的OD值。

1.2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡情況：常溫環境中使用20 μg/ml蛋白酶K培養0.5 h后去除蛋白，使用PBS緩沖液進行徹底清洗，之后將平衡緩沖液100 μl加入其中，室溫環境中平衡10 min，之后滴入TdT酶反應液100 μl，避光、室溫環境中孵育1 h，之后加入濃度為10 mg/ml的SSC溶液100 μl，常溫環境中靜置20 min后進行清洗3次，之后使用DAPI進行復染，避光培養10 min后再次進行清洗，封片觀察。DAPI復染細胞核呈藍色，凋亡細胞的細胞核呈綠色，取每切片3個視野進行觀察，計算細胞凋亡率，取平均值。

1.2.7 細胞周期分布、蛋白表達檢測：流式細胞儀檢測細胞周期分布，并進行組間比較。蛋白質印跡法(Western blotting)檢測p-Akt、mTOR、PTEN、Bcl-2、Bax、caspase3表達：取150 ℃ RIPA裂解液，1.5 ℃ PMSF冰中孵育30 min，1 500 r/min離心15 min，取上清。每個樣品取15 g蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉入PDVF膜，質量濃度為50 g/L的脫脂牛奶常溫下密封2 h。將4C加入抗體過夜。

2 結果

2.1 各組胃黏膜組織病理學特點正常組大鼠胃黏膜組織細胞排列較為規則，模型組大鼠胃黏膜組織細胞排列不規則，且可見炎癥細胞浸潤；藥物對照組大鼠胃黏膜組織細胞炎癥細胞浸潤現象減輕；Linifanib組大鼠胃黏膜組織細胞炎癥細胞浸潤現象明顯緩解，細胞排列較為規則(見圖1)。

圖1 各組胃黏膜組織病理學特點(放大200倍) A：正常組； B：模型組； C：藥物對照組； D：Linifanib組Fig 1 Histopathological characteristics of gastric mucosa in each group A: normal group; B: model group; C: drug control group; D: Linifanib group

2.2 各組大鼠MTL、GAS水平比較如表1所示，模型組大鼠MTL、GAS水平均低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；藥物對照組、Linifanib組大鼠MTL、GAS水平均低于正常組，高于模型組，且Linifanib組大鼠MTL、GAS水平均高于藥物對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 各組大鼠胃黏膜組織細胞增殖率及凋亡率比較如表2所示，藥物對照組、Linifanib組、模型組大鼠增殖率高于正常組，凋亡率低于正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)；Linifanib組、藥物對照組增殖率低于模型組，凋亡率高于模型組，且Linifanib組大鼠胃黏膜組織細胞增殖率低于藥物對照組，凋亡率高于藥物對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠MTL、GAS水平比較Tab 1 Comparison of MTL and GAS levels in rats of each

2.4 各組大鼠胃黏膜組織細胞周期分布情況比較如表3所示，模型組大鼠胃黏膜組織G1期細胞比例低于正常組S期、G2期細胞比例高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；藥物對照組、Linifanib組大鼠胃黏膜組織處于G1期的細胞比例均低于正常組，高于模型組，S期、G2期細胞比例低于模型組，高于正常組；Linifanib組大鼠胃黏膜組織G1期細胞比例高于藥物對照組S期、G2期細胞比例低于藥物對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠胃黏膜組織細胞增殖率、凋亡率比較Tab 2 Comparison of cell proliferation rate and apoptosis rate of gastric mucosal tissues in each group

表3 各組大鼠胃黏膜組織細胞周期分布對比Tab 3 Comparison of cell cycle distribution of gastric mucosa in rats in each group %)

2.5 各組大鼠p-Akt、mTOR、PTEN表達對比如表4、圖2所示，模型組大鼠p-Akt、mTOR相對表達量高于正常組，PTEN相對表達量低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；藥物對照組、Linifanib組大鼠p-Akt、mTOR相對表達量均高于正常組，低于模型組，PTEN表達高于模型組，且Linifanib組大鼠p-Akt、mTOR相對表達量均低于藥物對照組，PTEN表達高于藥物對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.6 各組大鼠Bcl-2、Bax、caspase3表達對比如表5、圖3所示，藥物對照組、Linifanib組大鼠Bcl-2、caspase3相對表達量均高于正常組，低于模型組，Bax表達低于正常組，高于模型組，且與藥物對照組比較，Linifanib組Bcl-2、caspase3表達較低，Bax表達較高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠p-Akt、mTOR、PTEN表達Tab 4 Expressions of p-Akt, mTOR and PTEN in each group

表5 各組大鼠Bcl-2、Bax、caspase3表達Tab 5 Expressions of Bcl-2, Bax and caspase3 in each group

圖2 各組大鼠p-Akt、mTOR、PTEN表達Fig 2 Expressions of p-Akt, mTOR, PTEN in each group

圖3 各組大鼠Bcl-2、Bax、caspase3表達Fig 3 Expressions of Bcl-2, Bax and caspase3 in each group

3 討論

胃癌癥狀的發生發展會對機體胃腸激素水平產生一定的影響，使機體胃腸道功能及胃動力造成嚴重的影響，進而使機體胃功能出現嚴重的下降[7-8]。MTL、GAS是廣譜的胃腸激素，具有促進胃腸運動、維持消化道結構、調節消化道功能的作用，對MTL、GAS水平進行檢測，能夠對機體胃功能進行較為準確的評價[9-10]。本文研究結果顯示，相比正常大鼠，胃癌大鼠MTL、GAS水平相對較低，說明胃癌癥狀的發生、發展抑制大鼠MTL、GAS的分泌，對大鼠胃功能造成嚴重影響；使用Linifanib進行干預后，胃癌大鼠MTL、GAS水平出現明顯上升，說明Linifanib能夠調控胃癌模型大鼠MTL、GAS水平，改善大鼠胃功能。胃癌發展與細胞增殖、凋亡關系密切[11]。王威等[12]在研究中對胃癌組織細胞增殖、凋亡能力進行檢測，結果顯示，胃癌細胞增殖、凋亡能力異常參與胃癌不斷發展。陳冬雪等[13]在研究中對胃癌細胞增殖、凋亡能力進行研究，結果顯示，使用刺五加皂苷對胃癌細胞進行干預，胃癌細胞增殖率下降，凋亡率上升，并由此得出適當的干預能夠改善胃癌細胞增殖、凋亡能力的結論。本研究結果顯示，使用Linifanib對胃癌大鼠干預，癌細胞增殖率下降，凋亡率上升。

Bcl-2和Bax是線粒體凋亡通路的重要成員，與癌組織細胞發生、發展密切相關[14-15]。caspase3作為caspase家族重要成員，與細胞凋亡密切相關[16]。本研究顯示，使用Linifanib對胃癌大鼠干預，Bcl-2、Bax、caspase3表達受到調控，說明Linifanib能夠通過調控Bcl-2、Bax、caspase3表達而抑制癌組織發展。

細胞周期分布是細胞活動的基礎生物學行為，其變化對細胞增殖凋亡能力的變化造成一定的影響，對細胞周期分布進行調控，能夠對細胞凋亡情況進行調控[17-18]。本研究顯示，使用Linifanib對胃癌大鼠干預，癌組織G1期細胞比例上升，說明Linifanib能對胃癌組織細胞周期分布進行阻滯，從而調控癌細胞凋亡能力。

p-Akt、mTOR、PTEN表達變化與細胞周期分布密切相關[19-20]。相比正常大鼠，胃癌模型大鼠p-Akt、mTOR表達較高，PTEN表達較低，使用Linifanib進行干預后，胃癌大鼠p-Akt、mTOR表達下調，PTEN表達上調，說明Linifanib干預能夠通過調控p-Akt、mTOR、PTEN表達而起到調控細胞周期分布的作用。

綜上所述，Linifanib能調控胃癌大鼠MTL、GAS水平，調控p-Akt、mTOR、PTEN及Bcl-2、Bax、caspase3蛋白表達，從而對大鼠胃黏膜組織增殖、凋亡及周期分布進行調控，為胃癌的臨床治療提供一定的理論依據。